マウス糸球体からの体液吸引:2光子媒介マイクロパンクチャーを用いたマウスからの糸球体液吸引法

腎臓では、糸球体(ボウマン嚢に囲まれた小さな血管の束)が血液濾過を開始し、老廃液を周囲のボウマン腔に排出します。糸球体液内容物の調査は、腎臓の生理学を理解するのに役立ちます。

糸球体液を吸引するには、麻酔をかけたマウスを腎臓を外科的に外部化した状態で準備します。次に、マウスの眼窩の後ろの血管に蛍光デキストラン色素を注入します。蛍光デキストラン分子は血流を通って移動し、腎臓に到達します。

デキストランの分子量が高いため、蛍光色素は糸球体内に保持され、糸球体に緑色を与えます。深く位置する構造を視覚化できる二光子顕微鏡の下で、糸球体液への適切なアクセスを得るために適切な糸球体を見つけます。

次に、赤色蛍光ナノ粒子でコーティングされたマイクロピペットチップを腎臓の横軸に合わせます。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットチップを腎臓に浸透させるように進めます。先端がターゲット糸球体に到達したら、ボウマン腔から糸球体液を吸引するための希望の吸引速度を設定します。

赤いピペットチップ内に緑色の蛍光がないことは、出血がないことを示し、糸球体液吸引が成功したことを確認します。その後、ピペットを引っ込め、さらなる分析のために液体を適切なバッファーに保管します。

つま先を挟むと反応がないことを確認した後、20〜25グラムの成体マウスの四肢を目に軟膏を塗り、テープで固定します。脱毛クリームを使用して動物の左側の毛をすべて取り除き、脾臓を使用して脾臓の背側と尾側の皮膚を通して左腎臓を見つけます。

皮膚に0.5センチメートルの切開を行い、続いて腹膜に腎臓が押し込まれるのに十分な大きさの小さな切開を行います。穏やかな圧力で腎臓を押し出し、組織の周りにポリシロキサン腎臓安定剤を配置します。腎臓の最外側の表面がスタビライザーを約1ミリメートル超えるように腎臓をスペーサーに並べ、シアノアクリレート接着剤で腎臓をフォームに固定します。スタビライザーフォームにヘッドプレートを接着し、ベースプレートの取り付けバーにヘッドプレートを取り付けます。

次に、ポリシロキサン支持体のウェルに1%アガロース溶液を充填し、アガロースが固まるまでフォームの上に10ミリメートルのカバーガラスを保持します。カバーガラスをヘッドプレートに接着剤で密封し、歯科用セメントでカバーガラスの周りにリングを作成します。次に、100〜150マイクロリットルのFITC-デキストランを軌道後部に注入し、マウスと固定プレートを2光子顕微鏡ステージにすばやく移動させます。

腎臓表面に手動で焦点を合わせた後、非走査型二光子モードに切り替え、イメージングウィンドウを調べて、カバーガラスの下30マイクロメートル以上、外側腎嚢から400マイクロメートル未満の標的糸球体を見つけます。標的糸球体までの横方向と垂直方向の距離を記録します。次に、糸球体のx、y、z段階座標を記録し、最後にxとy段階の座標を変えずに、対物の焦点を水柱に約1ミリ上げます。

ピペットチップを水柱に打ち込み、DAPI励起をオンにします。X寸法とY寸法のピペットをチップの最大蛍光点まで移動します。これが目標の中心になります。励起設定を赤色蛍光タンパク質に変更し、ピペットを眼球で視覚化して、眼球ビューで正確なセンタリングを可能にします。

2光子に戻して、ライブ2光子ビューの下にピペットを見つけ、チップを画像の中央に正確に配置します。こちらが登録ポジションです。次に、ピペットの画像を保存し、ステージとマイクロピペットコントローラーの座標を登録します。y軸とz軸を動かさずにx軸の水柱からピペットを取り出し、ピペットZをターゲット糸球体のZ座標と腎臓の端に移動します。

ステージXに注意し、レジストレーションステージXからのオフセットを使用してキドニーエッジピペットXを計算します。ステージXを大きくして、キドニーの端が画面の左はるかに見えるまでステージをピペットに向かって移動します。計算したように、ピペットを腎臓端ピペットXから約100マイクロメートル離れたところまですばやく進めます。赤色のゲインを上げ、赤色のピクセルヒストグラムを監視しながら、ライブ2光子イメージング下でピペットチップを腎臓の端までゆっくりと前進させ始めます。

ステージXに目を光らせながら、X軸のピペットを糸球体ターゲットピペットXまでゆっくりと駆動します。糸球体に到達したら、Zスタックで位置を記録します。ピペットを所定の位置に置いた状態で、マイクロポンプを2分間かけて100ナノリットルのパーフルオロデカリンを注入するように設定し、ピペットの開存性を確保し、挿入中のピペットの詰まりによる交絡を減らします。4〜6分間のろ過後、マイクロポンプを毎分最大50ナノリットルの速度で最大30ナノリットルを吸引するように設定します。