ニワトリCAM上の腎臓器官型培養:腎血管構造の形成を誘導するためのニワトリCAM上のマウス腎臓外植片の移植技術

ニワトリ絨毛尿膜 (CAM) は、卵の殻の下に存在する高度に血管新生された自然免疫不全層です。CAMは、異種移植、つまりドナー生物から別の種のレシピエントへの組織の異種移動の理想的なモデルとして機能します。

ニワトリCAMで腎臓器型培養を行うには、まず基部に透過性膜が存在するミニリザーバーを採取します。ミニリザーバーを反転させ、ペトリ皿に存在する培地の一滴の上に置きます。これにより、膜が媒体と直接接触することが保証されます。マウス腎臓外植片を事前に濡れた膜に移します。腎臓の周りの余分な媒体を吸引します。

腎臓外植片の膜への付着を容易にするためにインキュベートします。次に、完全に発達したCAMを示す胚性ニワトリから卵外培養物を取ります。胚の周辺にある顕著な血管を見つけます。腎臓外植片が取り付けられたリザーバーを取り、膜が腎臓外植片をCAM組織に押し付けるように、CAMの上に反転させます。

腎臓外植片の成長をサポートし、収縮を防ぐために、リザーバーに培地を補給します。長期間栽培します。CAM 血管は移植された腎臓に浸潤し、腎外植片内の血管新生を誘導し、CAM 組織上の機能的な腎臓の再現を刺激します。

実験に応じて、6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたトランスウェル細胞培養インサートを使用します。Dremel ツールを使用してインサートのサイズを縮小し、透過性膜が取り付けられた高さ 2 mm のプラスチック リングを作成します。

メスや鋭利なナイフで切りくずからリングの端を磨きます。ミニリザーバーを70%エタノールで少なくとも1時間滅菌します。次に、ミニリザーバーをオートクレーブで蒸留水で洗浄し、層流フードで乾燥させる。ミニリザーバーをPBSと培地ですすぎます。

リザーバーを培地の一滴の上に、膜を上に向けて培地の上のペトリ皿の上に置きます。解剖されたex vivo胚性腎臓または腎臓オルガノイドを膜上に配置します。サンプルの周囲に多くの液体を残さず、細胞培養インキュベーターで2〜24時間付着させます。

異

種移植は、生後8日のex vivo胚性ニワトリの絨毛尿膜に行われます。膜が移植片を覆うようにミニリザーバーを移します。胚を覆わないように、CAMの周辺に配置します。

次に、培地をミニリザーバーに追加します。チキンCAMでサンプルを最大9日間培養します。ミニリザーバーの培地を毎日交換してください。サンプルの血管新生は、移植後24〜48時間ですでに観察できます。