ミクログリア食作用アッセイ:iPS細胞マクロファージを用いた神経芽腫細胞のミクログリア食作用モデルを確立するためのIn vitroアッセイ

ミクログリアは、食作用と呼ばれるプロセスによって病原体、細胞破片、癌性神経細胞または神経芽細胞腫を除去するのに役立つ脳マクロファージです。

イン

ビトロで食作用を模倣するには、パラホルムアルデヒドに固定された神経芽細胞腫細胞の培養から始めます。

化学固定剤であるパラホルムアルデヒドは、ホスファチジルセリンなどの膜リン脂質をランダムに分布させ、細胞膜の外面に転座させると同時に細胞構造を安定させます。

次に、pH感受性アミン反応性蛍光色素を神経芽細胞腫細胞培養物に加え、インキュベートします。

色素分子は神経芽細胞腫細胞表面のホスファチジルセリンのアミン基に結合

する

チューブを遠心分離し、結合していない色素分子を含む上清を除去します。細胞ペレットを適切なバッファーと遠心分離機ですすぎます。

上清を取り除き、ペレットを培地に再懸濁します。

次に、事前に染色されたマクロファージを培養プレートにシードします。染色されたマクロファージは、青い核で赤く見えます。

染色した神経芽細胞腫細胞をこの培養物に加え、インキュベートします。

マクロファージ食作用受容体は、神経芽細胞腫細胞上で露出したホスファチジルセリンを認識し、ファゴソームと呼ばれる膜コンパートメントにそれらを内在化します。

ファゴソームは移動してリソソームと融合し、神経芽細胞腫細胞をリソソームの低pH環境にさらします。pHが低いと、神経芽細胞腫細胞上の色素分子が活性化され、色素の色が変化します。

蛍光顕微鏡下では、食作用された神経芽細胞腫細胞は、赤色マクロファージの内部で黄色に見えます。

SH-SY5Ysを15ミリリットルの円錐形遠心分離管にピペットで入れます。400 x g で 5 分間遠心分離します。上清を吸引し、2ミリリットルのフェノールレッドフリーHEPES緩衝培地に細胞を再懸濁し、固定前に塊を分解するようにします。

2ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドをチューブに加え、時折穏やかに攪拌しながら室温で10分間インキュベートすることにより、細胞を固定します。10ミリリットルのHBSSをチューブに加えます。

次に、1,200 x g で 7 分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを2ミリリットルのフェノールレッドフリーHEPES緩衝培地に再懸濁します。100万個のSH-SY5Y細胞をカウントし、2ミリリットルの低タンパク質結合チューブに取り出します。

フェノールレッドフリーのHEPES緩衝培地で総容量を300〜500マイクロリットルにします。次に、摂氏37度の水浴でチューブを短時間温めます。pH感受性赤色蛍光色素STPエステルを製造元の指示に従って再構成します。

次に、100万個のSH-SY5Y細胞あたり12.5マイクログラムの色素を加えます。チューブをフリックして穏やかに混合し、光を避けて室温で30分