新鮮凍結神経膠腫組織からの核の単離:神経膠腫腫瘍サンプルから無傷の核を得る方法

核を単離するには、新鮮な凍結神経膠腫サンプル(脳のグリア細胞に由来する腫瘍)をペトリ皿で採取することから始めます。

組織の劣化を避けるためにシャーレを氷の上に置きます。

次に、組織サンプルを細かく

刻みます。

みじん切りにした組織片に、事前に冷却した溶解バッファーを加えます。混合物をDounceホモジナイザーに移します。乳棒を使用して、組織を均質化して細胞を崩壊し、溶解を開始します。

次に、ホモジネートを新鮮な溶解バッファーを含む微量遠心チューブに移します。

広口径ピペットチップを使用してホモジネートを機械的に破壊します。このステップは、細胞からの細胞質細胞小器官の放出を促進します。

続

いて、適切なサイズの細胞ストレーナーを使用して、ホモジネートを新しいチューブにろ過し、組織の破片やその他の汚染物質を除去します。

ろ

過後、さまざまな細胞小器官を含む濾液を取ります。

濾液を低速で遠心分離して、他の細胞小器官が上清に残っている間、底の密度の高い核をペレット化します。

細胞小器官を含む上清を廃棄します。粗核に富むペレットを適切な保存バッファーに保存し、さらなる下流のシーケンシングを行います。

まず、10〜60ミリグラムの新鮮な凍結組織サンプルを予冷したペトリ皿に移します。新鮮な冷凍組織をカミソリの刃で氷の上で細かく刻むか、切り刻みます。500マイクロリットルの冷却核溶解バッファーをペトリ皿の組織に加えます。

次に、混合物をダウンサーに移します。摩擦が減少するまで、「緩い」乳棒で組織片を約20ストロークします。次に、「タイトな」乳棒で20ストロークして、組織を完全に均質化します。

ホモジネートを予冷した2ミリリットルのチューブに移し、1ミリリットルの冷やした溶解バッファーをダウンサーに加え、すすぎ、チューブに加えます。穏やかに混ぜて氷上で5分間インキュベートし、インキュベーション中にワイドボアピペットチップで1〜2回

混合します。

30 マイクロメートルのストレーナー メッシュを使用してホモジネート全体をろ過し、15 ミリリットルのファルコン チューブに集めます。次に、新しい予冷した 2 ミリリットルのチューブに戻します。通常、ホモジネート全体には 1 つのストレーナーで十分です。

サンプルを光学顕微鏡でチェックし、大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。核は丸くする必要はなく、核膜が歪んでいてはなりません。破片が存在する場合は、ろ過を繰り返します。

次に、核を卓上遠心分離機で5分間遠心分離します。上清を取り除き、約50マイクロリットルの核含有ペレットを残します。ペレットを別のミリリットルの核溶解バッファーに静かに再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。

遠心分離を繰り返します。次に、ペレットを乱すことなく上清を除去します。500ミリリットルのHBを加え、再懸濁