JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 3:05 分 • April 30th, 2023
無傷の核を単離して精製するには、まず粗核画分をチューブに取ります。画分には、壊れた核の断片や破片とともに無傷の核が含まれています。
この画分を適切な密度勾配媒体と混合して、最低濃度の懸濁液を形成します。
次に、事前に準備された粗核画分の下に同じ勾配媒体の密度を増加させる溶液を層状にして、多段階の不連続密度勾配を生成します。このステップにより、粗核画分が勾配の上部にバンドを形成できます。
次に、チューブを低速で遠心分離します。
形や質量の違いにより、無傷の原子核は破片や核破片とは異なる移動をする。これにより、無傷の原子核が別のバンドを形成します。
遠心分離後、密度勾配溶液の界面に無傷の核からなる別個のバンドを見つけます。
ピペットを使用して、グラジエントの最上層を吸引し、純粋な核バンドへのアクセスを容易にします。核含有バンドを新しいチューブに集めます。
これらの核を光学顕微鏡で視覚化します。無傷の核は完全に丸く見え、周囲には無傷の核膜があります。
最後に、さらなる分析のために純粋な核画分を保存します。
200マイクロリットルの50%ヨウジキサノール溶液を核に加え、最終濃度25%ヨウジキサノールにし、300マイクロリットルに設定したピペットで10回混合します。
次に、層の混合を避けるために、P1000 細いチップを使用して 25% 混合物の下に 300 マイクロリットルの 29% ヨウジキサノール溶液を加えます。P300の細いチップで29%混合物の下に1000マイクロリットルの35%ヨウジキサノール溶液を加えます。その後、ゆっくりと取り外します。
サンプルをスイングバケット遠心分離機に入れ、ブレーキを切った状態で摂氏4度で3,500 x gで20分間回転させます。
サンプルを振らずにそっと取り出し、光の下で観察します。純度95%の核の透明な白い帯が、2層目と3層目の間に見えるはずです。
核を分離するには、最上層を吸引して界面の白い核バンドを露出させます。核バンドを200ミリリットルの容量で収集し、新しいチューブに移します。次に、20マイクロメートルのフィルターでろ過します。
光学顕微鏡で核をチェックし、大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。それらは丸く、核膜が歪んではいけません。