JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 4:00 分 • April 30th, 2023
タンパク質のユビキチン化は、ギリギシン残基を介して基質タンパク質のリジン残基にユビキチン(調節ミニタンパク質)を付加することを特徴とします。これにより、基質タンパク質とユビキチンの間にリジン-グリシン-グリシン結合が生成されます。
ユビキチンタグ付きペプチドを単離するには、まずペプチドミックスを摂取します。
これらのペプチドをエンドヌクレアーゼ酵素カクテルで処理します。処理中、酵素Lys-Cとトリプシンは、アルギニン残基でユビキチン化ペプチドを効率的に切断し、特徴的なジグリシンモチーフを含むペプチドフラグメントを生成します。
これらのペプチドフラグメントを抗体結合ヒドロゲルビーズのスラリーに加えます。
これらの抗体には、ユビキチン化ペプチドにのみ結合し、ペプチド-ビーズ複合体を形成するジグリシン認識部位が含まれています。
ユビキチニル化ペプチド-ビーズ複合体をペレット化するための遠心分離機。結合していない非ユビキチニル化ペプチド含有上清を除去します。
複合体をフィルターアセンブリにロードします。遠心分離してバッファーを除去し、ペプチド結合ビーズをトラップします。
pHを下げる酸性化試薬を加え、ビーズからペプチドを剥離させます。
濾液から遊離ペプチドを回収します。疎水性マトリックスを含む新しいフィルターにそれらをロードします。ペプチドはマトリックスに保持されますが、酸性塩は洗い流されます。
適切な溶媒を使用して、ペプチドを剥離します。
ユビキチニル化ペプチドを新しいチューブに移し、乾燥させて微量の溶媒を除去します。
プロテインAアガロースビーズスラリーに結合したユビキチン残存モチーフ抗体の1バッチを6つの等しい画分に分割します。原稿の指示に従って3つのペプチド画分を溶解し、破片をスピンダウンします。
3つの画分の上清をビーズスラリーに加え、他の3つの画分を氷上に保ち、回転装置で摂氏4度で2時間インキュベートします。
次に、ビーズを回転させます。上清をビーズの新しいバッチに移し、残りの3つのビーズスラリー画分でインキュベーションを繰り返します。
その後のグローバルプロテオーム分析のために上清を保存し、GF/Fフィルタープラグを備えた200マイクロリットルのピペットチップにビーズを移します。
チップを遠心分離機チップアダプターを備えた1.5ミリリットルのチューブに入れ、200マイクロリットルの氷冷IAPバッファーでビーズを3回洗浄し、続いて氷冷精製水で3回洗浄します。
カラムを200 x g で2分間回転させ、カラムが乾燥しないように注意します。最終洗浄後、50マイクロリットルの0.15%TFAの2サイクルでペプチドを溶出します。C18ステージチップでペプチドを脱塩し、真空遠心分離で乾燥させます。