SEC法によるミクログリア由来の細胞外小胞の単離:ミクログリア馴化培養培地から細胞外小胞を単離する技術

ミクログリア細胞は、より大きなアポトーシス小体やより小さなマイクロサイズの小胞を含む細胞外小胞またはEVの形で免疫メディエーターをin vitroで増殖培地に放出します。

EVを分離するには、ミクログリア調整培地を採取することから始めます。この培地には、放出されたEVとともにミクログリア細胞が含まれています。培地を遠心分離して細胞をペレット化します。

EV、破片、タンパク質凝集体を含む上清を新鮮なチューブに集めます。再度遠心分離して、細胞破片と大きなアポトーシス小体を除去します。

上清を超遠心チューブに移します。高速で遠心分離します。

使用済み培地を含む上清を廃棄し、EVおよびタンパク質凝集体ペレットを目的のバッファーに再懸濁します。

同時に

、ベースに適切なフィルターを備えたサイズ排除クロマトグラフィーカラムを取ります。

定義された孔径の多孔質ふるいを形成する球状ゲルビーズからなるゲルろ過マトリックスでカラムをしっかりと充填します。

静止相の上にEVとタンパク質凝集懸濁

液をロードします。

懸濁液がカラムを通過すると、大型のEVはゲルビーズ間の粒子間空間を通過し、より短い経路を移動します。対照的に、より小さなサイズのタンパク質凝集体は、より長い経路をたどって細孔に移動します。

その結果、EVは最初にカラムから溶出します。

EVを含む画分を収集し、さらなる分析に使用します。

ミクログリア培養物またはマクロファージ培養物からコンディショニング培地を円錐形のチューブに移し、1,200 x g で10分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を新しい円錐形のチューブに移し、さらに20分間遠心分離してアポトーシス小体を除去します。

次に、上清を10.4ミリリットルのポリカーボネートチューブに移します。チューブを70.1 Tiローターに入れ、摂氏4度で90分間100,000 x g で超遠心分離してEVをペレット化します。遠心分離後、上清を廃棄し、ペレットを200マイクロリットルの0.2マイクロメートルろ過PBSに再懸濁します。

EVを単離するには、ガラスクロマトグラフィーカラムを洗浄および滅菌し、下部に60マイクロメートルのフィルターを配置することにより、自家製のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを準備します。架橋アガロースゲルろ過ベースマトリックスとカラムを積み重ねて、直径0.6センチメートル、高さ20センチメートルの固定相を作成します。

次に、50ミリリットルの0.2マイクロメートルろ過PBSで相をすすぎます。必要に応じて、後で使用するためにカラムを摂氏4度で保管してください。再懸濁したEVペレットを固定相の上に置き、固定相の上部にPBSを添加し続けながら、250マイクロリットルの連続画分を20回収集します。フラクションは摂氏マイナス20度で保存できます。