SDS-PAGEに基づく細胞外小胞関連タンパク質の抽出:EVからタンパク質を抽出し、それらをゲル内消化のために調製する手順

まず、無傷の細胞外小胞またはEVを含むチューブを取ります。

EVを所望の量の溶解バッファーに懸濁し、サンプルを超音波処理します。この処理は、EV膜を溶解し、遺伝物質をせん断し、タンパク質を緩衝液に放出します。

細胞破片とせん断された遺伝物質をペレット化するための遠心分離機。各種タンパク質を含む上清を採取します。

タンパク質抽出物にローディング色素を加え、SDS-PAGEゲル上で実行します。

ゲルを染色液に浸して、色素分子がタンパク質に結合できるようにします。目的のタンパク質を含む染色バンドを見つけて

切除します。

着色されたバンドを細かくカットして、後続のステップで酵素へのタンパク質のアクセスしやすさを改善します。これらの破片を微量遠心チューブに移します。

染色染料を除去する脱色液を追加します。使用済みの脱色液を取り除きます。

還元液を追加します。還元剤がタンパク質のジスルフィド結合を切断し、遊離スルフヒドリル基を露出させるためにインキュベートします。

還元タンパク質をアルキル化溶液で処理します。アルキル基は遊離スルフヒドリル基に結合し、タンパク質を折りたたんだ状態に保

ちます。

余分な溶液を廃棄し、脱水溶液で破片を洗浄してアルキル化試薬を除去します。ジェルを完全に乾かします。

ゲル片は、さらなるプロテオミクス分析の準備が整いました。

タンパク質抽出の場合は、50マイクロリットルのRIPAバッファーをEVサンプルと氷上で5分間混合します。サンプルを500ワットと20キロヘルツで5秒間3回超音波処理します。次に、摂氏4度で10分間、20,000×gで遠心分離して小胞の破片を除去します。

タンパク質を単離した後、12%ポリアクリルアミドゲルのスタッキングゲル内でタンパク質の移動を行います。室温で20分間、クマシーブルーでゲル内のタンパク質を固定します。次に、色付きの各ジェル片を切除し、細かく切ります。

原稿に記載されているように、ジェル片を一連の連続した洗浄にかけます。その後、真空濃縮器で完全に乾燥させます。乾燥後、10ミリモルのジチオスレイトールを含む100ミリモルの重炭酸アンモニウム100マイクロリットルで摂氏56度で1時間タンパク質還元を行います。

次に、50ミリモルのヨードアセトアミドを含む100マイクロリットルの100ミリモル重炭酸アンモニウムで、暗所で45分間タンパク質アルキル化を行います。原稿の指示に従ってゲル片を洗浄し、真空濃縮器で完全に乾燥させます。