0 閲覧数 • 3:05 分 • April 30th, 2023
固形腫瘍によって放出される特定の化学誘引物質に応答して、腫瘍関連マクロファージやTAMなどの免疫細胞が固形腫瘍に浸潤します。その後、これらのTAMは腫瘍の進行を促進します。
TAMと腫瘍細胞の間の相互作用をin vitroで研究するには、まず膜状インサートを備えたマルチウェルプレートを採取します。この配置により、井戸は一時的に 2 つの区画に分離されます。
次に、TAMの懸濁液をトランスウェルの上部コンパートメントに追加します。
トランスウェルの下部コンパートメントに、腫瘍細胞から分泌される化学誘引物質が豊富なコンディショニング培地を補充します。
プレートを所望の時間インキュベートします。
インキュベーション中、化学変調剤はTAMを引き付けます。これにより、化学誘発走化性を介して多孔質インサート膜を介してTAMが下部コンパートメントに移動します。
次に、ウェルからインサートを取り外します。移行TAM集団を含むコンディショニング培地を、蛍光測定に適したプレートに移します。
蛍光色素を含む溶解バッファーで細胞を処理します。このバッファーはマクロファージを溶解します。最終的に、色素分子は核酸に結合し、蛍光が増します。
最後に、蛍光プレートリーダーを使用してプレートをスキャンします。高い蛍光は、化学誘発性走化性によるマクロファージの移動が成功していることを示します。
まず、必要な材料を室温に戻します。調製したMV-4-11細胞を各インサートに250マイクロリットルを加えます。次に、400マイクロリットルのコンディショニング培地/培地のみを24ウェルプレートの下部チャンバーに追加し、サンプルを3回追加するようにします。
摂氏37度で5%の二酸化炭素とともに4時間インキュベートします。次に、同じウェルの内壁にあるインサートを軽くたたき、インサートを廃棄します。ウェル内の細胞を上下に3回静かにピペットで移動させて混合します。
この細胞懸濁液225マイクロリットルを、蛍光測定に適した黒壁の96ウェルプレートのウェルに移します。この後、CyQuant色素を4x溶解バッファーで1:75の比率で希釈します。短時間ボルテックスして、溶液をスピンダウンします。
この溶液75マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに移し、室温で15分間インキュベートします。蛍光プレートリーダーを使用して、蛍光を読み取り、テキストプロトコルに概説されているようにデータを分析します。