DNA合成アッセイ:放射性トリチウム化チミジン取り込み法を用いて増殖細胞におけるDNA合成を評価する技術

接

着細胞を含むマルチウェルプレートを採取することから始めます。

これらの細胞をトリチウム化チミジン(チミジンの放射性バージョン)を含む培地で処理し、インキュベートします。

インキュベーション中、活発に複製される細胞には放射性チミジンが組み込まれます。このチミジンはアデノシンと対になり、増殖細胞で放射性標識DNAを生成します。

使用済み培地をウェルから取り除きます。溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、DNAを懸濁液に放出します。

ハーベスターの収集チューブをマイクロプレートのウェルの上に置いて、細胞ハーベスターアセンブリを準備します。

吸引圧力を加えて、ウェルから浮遊DNAを吸引できるようにします。このDNAはろ紙上に沈着し、特定のスポットを形成します。

DNAの斑点のあるろ紙チャドを切り取ります。これらのチャドを個別にシンチレーションバイアルに移します。

ろ紙にシンチレーションカクテルを重ねます。バイアルを液体シンチレーションカウンターに入れます。

カウンターの内部では、標識されたDNAが放射性崩壊によってエネルギーを放出します。このエネルギーはシンチレーションカクテルの成分に吸収されます。最終的に、カクテル成分がパルスを伝達し始め、パルスはセンサーに吸収されます。

検出された放射能の量によって、細胞分裂の程度が決まります。

24ウェルプレートの3回ウェルに100,000細胞をプレートします。46時間後、トリチウム化チミジンを培地に加え、摂氏37度で2時間インキュベートします。

次に、培地を取り除いた後、300マイクロリットルの予熱した0.25%トリプシン-EDTAを加え、摂氏37度で20分間インキュベートして細胞を分解し、DNAを放出します。次に、細胞ハーベスターの電源を入れ、ポンプをオンにします。

ろ紙を細胞ハーベスターに入れます。細胞収穫機のチューブを空のブランクトレイに集め続けます。次に、予備洗浄を押して濾紙を濡らします。収集チューブをサンプルウェルに入れて開始します。

熱光源を使用してろ紙を乾燥させ、対応するバイアルをトレイに配置します。バイアルに紙のチャドを打ち抜き、各バイアルに2ミリリットルの液体シンチレーションカクテルを加えます。

バイアルをシンチレーションカウンターで1時間インキュベートしてから、機械を操作して、活性DNA合成を反映する各サンプルの毎分カウントを取得します。