JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 4:02 分 • April 30th, 2023
神経球は、神経前駆細胞またはNPCの非接着性球状凝集体です。
特定の接着培養条件下でプレーティングすると、NPCは神経圏から自発的に移動する可能性があります。
NPCの移動応答を評価するには、まず、適切な培地で所望の密度のNPC懸濁液を調製します。
次に、細胞懸濁液を培地を含む培養プレートに播種し、インキュベートします。
培地中の特定の成長因子は、細胞の増殖をサポートします。さらに、コーティング基質がないため、細胞は培地中に浮遊したままになり、ニューロスフィアと呼ばれる 3D 細胞凝集体の形成が容易になります。
希望のサイズに達したら、神経球を集めます。
ニューロスフェアペレットを遠心分離し、希釈した培地に再懸濁します。
次に、ニューロスフィア懸濁液を希釈培地を含む細胞外マトリックスコーティングプレートにプレートし、インキュベートします。
培養中、神経球は細胞外マトリックスに付着します。
時間が経つにつれて、細胞外マトリックスの成分により、少数のNPCが神経球コアから遠ざかり始めます。
次に、メディアを取り外してセルを固定します。
細胞遊走を示す神経球の位相差画像をキャプチャします。
適切なソフトウェアを使用して、総神経球の面積と内部細胞質量を測定します。
最後に、神経球全体の面積から内部細胞質量面積を差し引いて、神経球からの平均NPC移動を計算します。
神経球を形成するには、100%膨張培地1ミリリットルをコーティング基板なしで35ミリメートルの皿にピペットで入れます。次に、これらの各プレートに100万個の神経前駆細胞を加え、プレートを摂氏37度で48〜96時間インキュベートします。
神経球移動用にプレートを準備するには、ECM模倣ゲルアリコートを6ミリリットルの30%膨張培地に溶解します。1ミリリットルのECM模倣ゲルと30%膨張培地を6ウェルプレートのシングルウェルに加えます。次に、プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。
神経球をプレートするには、ピペットを使用して35mmの皿から培地中の細胞を収集し、それらを円錐形のチューブに移します。次に、チューブを100 x gで回転させて神経球をペレット化します。次に、ペレットを1〜3ミリリットルの予熱した30%膨張培地に再懸濁します。
次に、再懸濁した神経球200マイクロリットルを、30%膨張培地を含むECM模倣ゲルを含む6ウェルプレートにピペットで入れ、プレートを揺らします。次に、プレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。ECM模倣ゲルを30%増殖培地で吸引し、4%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を30分間固定します。
神経球を分析するには、位相差設定を使用して 10 倍の倍率で画像をキャプチャします。NIH ImageJソフトウェアを使用して、神経球の平均移動を測定します。ImageJ で、フリーハンド ライン ツールを使用して、神経球の外側の輪郭をトレースします。
次に、関数 measure を使用してトレース面積を計算し、球の内部セル質量をトレースします。神経球全体の面積から内部細胞質量を差し引いて、平均移動を定量化します。