アストロサイト単離:マウス皮質アストロサイトの純粋な調製を得る方法

アストロサイト in vitro 培養は、最も豊富な脳細胞であるアストロサイトの生物学的役割を調査するのに役立ちます。

顕微鏡下に置かれた新生児マウスの脳から始めます。

嗅球と小脳を取り除きます。

2つの半球の間に正中線切開を行い、皮質を分離します。

線維芽細胞および髄膜細胞からの星状細胞培養の汚染を避けるために髄膜を除去します。

皮質半球を氷のように冷たい媒体に移し、細か

トリプシンを含むチューブに皮質片を集めます。プロテアーゼ酵素であるトリプシンは、細胞接着タンパク質を消化し、細胞分離を促進します。

遠心分離機で消化された組織をペレット化します。

上清を取り除き、アストロサイト培地をペレットに加えます。激しくピペットを切って、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞またはOPCの混合細胞集団を放出します。

この細胞懸濁液をポリリジンコーティングされた組織培養フラスコに播種し、インキュベートします。

負に帯電した細胞は、正に帯電したポリリジンに付着し、表面全体に成長してコンフルエント層を形成します。

フラスコを振って、緩く結合したミクログリアとOPCを切り離します。剥離した細胞を含む上清を取り除きます。

アストロサイト層にトリプシンを加えます。細胞を集めて遠心分離します。

ペレットを再懸濁し、アストロサイトを複数のフラスコに分割します。

最後に、細胞特異的マーカーを免疫染色することにより、アストロサイト培養の純度を評価します。

脳の入った皿を実体顕微鏡に移します。次に、皮質を分離するために、細い鉗子で各脳の後端をつかみ、半球の間に正中線切開を行います。

次に、作成された溝に2番目の鉗子セットを挿入し、皮質の板状の構造を脳の残りの部分から剥がします。

すべての皮質が分離されたら、細い鉗子で引っ張って髄膜を皮質から慎重に剥がします。このステップにより、髄膜細胞および線維芽細胞による最終的な星状細胞培養の汚染が回避されます。

準備した皮質半球を冷やしたHBSSで満たされた2番目の皿に移し、氷の上に置きます。それに応じて、4つの皮質すべてで続けます。最後に、鋭利な刃を使用して各半球を4〜8つの小さな断片に切ります。

無菌条件下で、皮質の断片を1本の50ミリリットルのファルコンチューブに移し、HBSSを最終容量22.5ミリリットルまで添加します。次に、2.5ミリリットルの2.5%トリプシンを加えます。

キャップを元に戻し、混合し、組織を摂氏37度のウォーターバスで30分間インキュベートします。10分ごとに振って混ぜます。次に、300 x g で 5 分間遠心分離して皮質組織片をペレット化した後、上清を慎重にデカントします。

レットに10ミリリットルのアストロサイトプレーティング培地を加え、10ミリリットルのピペットを使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで、組織を含む培地を上下に20〜30回激しくピペットします。

次に、アストロサイトプレーティング培地を最終容量20ミリリットルまで添加し、標準的な手順に従って血球計算器または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。

4つのマウスの子犬皮質の1つの調製物は、10〜15倍の10〜10〜6番目の解離した単一細胞を生成するはずです。最後に、事前に調製したフラスコからポリ-D-リジンを吸引し、解離した細胞懸濁液をフラスコに移します。

培養物を組織培養インキュベーターで摂氏37度で2日間インキュベートし、培地を交換します。その後、メディアは3日ごとに交換する必要があります。

アストロサイトは、培養中で7〜8日後に、ミクログリアの上層と合流しているように見えるはずです。この時点で、T75フラスコを毎分180回転に設定したオービタルシェーカーに30分間セットし、ミクログリアを除去します。

ミクログリアを含む上清を廃棄するか、スピンダウンして培養用にプレートします。次に、20ミリリットルの新鮮なアストロサイト培地を加え、フラスコを240rpmで6時間振とうして、オリゴデンドロサイト前駆細胞を除去します。

一部のOPCはアストロサイト層から完全に剥離しないため、OPC汚染を防ぐために、手で1分間激しく振とう続けます。繰り返しますが、上清を廃棄するか、プレート上で回転させてOPCを培養します。

残りのコンフルエント星状細胞層をPBSで2回すすぎます。PBSを吸引し、5ミリリットルのトリプシン-EDTAを加えます。組織培養インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。

5分ごとにアストロサイトの剥離をチェックし、フラスコを手のひらに2〜3回叩いてアストロサイトの剥離を強制します。

アストロサイトがフラスコから外れたら、5ミリリットルのアストロサイト培地を加えます。細胞を180 x g で5分間回転させ、上清を吸引し、40ミリリットルの新鮮な星状細胞プレーティング培地を加えます。

混合皮質細胞の1つのT75フラスコは、最初の継代後に星状細胞に富んだ6番目の細胞から約10倍を生成するはずです。