JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 8:27 分 • April 30th, 2023
脳内皮細胞を単離するには、まず、採取したラットの脳を冷やした緩衝液の入った皿に移します。
小脳と視神経を取り除いた後、脳を大脳半球に分けます。次に、中脳を前脳から分離します。
前脳から髄膜とミエリンを含む白質を取り除き、微小血管を分離するための脳皮質を残します。
次に、皮質を均質化して神経組織と成分を破壊します。
ホモジネートを遠心分離して、細胞破片とミエリンを除去します。
続いて、組織ペレットをコラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼ酵素を含む消化カクテルで処理します。
コラゲナーゼと分散酵素は、微小血管を埋め込む細胞外マトリックスを消化し、組織から微小血管断片を緩めます。デオキシリボヌクレアーゼは、溶解した細胞から放出された遊離DNAを分解します。
消化されたホモジネートの所望の量を適切な密度勾配培地および遠心分離機と混合します。
ミエリンと脳実質細胞を含む最上層を廃棄し、次に上清を廃棄します。
次に、微小血管を含むペレットを消化カクテルで処理して、内皮細胞と周皮細胞を含む微小血管断片を完全に放出します。
懸濁液を遠心分離します。微小血管断片含有ペレットを、抗生物質であるピューロマイシンを添加した適切な培地に再懸濁します。
懸濁液を細胞外マトリックスタンパク質コーティングプレートに播種し、インキュベートします。
微小血管の破片はプレートのコーティングに付着します。ピューロマイシンは周皮細胞を選択的に除去し、培地成分は内皮細胞の増殖を促進します。
生後5週間のWistarラット3匹の頭蓋骨から脳を取り出し、氷の上に保持された冷たい解剖バッファーで満たされたペトリ皿に脳を移します。
小脳と視神経のない脳を解剖します。次に、各脳を半分に切って、2つの大脳半球を分離します。
実体顕微鏡下で、別の切り込みを入れて中脳を取り除き、すべての前脳を解剖バッファーを入れた氷上のきれいなペトリ皿に移します。
次に、1つの前脳を冷解バッファーで満たされた新しいペトリ皿に移します。クランプで持ち、髄膜を前脳の端から慎重に切り離します。
その後、前脳を裏返し、髄膜を引き裂かずに慎重に引き抜きます。前脳から髄膜が取り除かれ、視神経の残りの部分が切断されていることを確認してください。このステップの目的は、白質の羽毛布団を取り除いて皮質の殻を得ることです。
前脳の端をクランプすることから始めて、皮質の表面を引き裂かないように注意しながら、鉗子を表面に沿って慎重にドラッグします。
次に、脳を転がして髄膜が残っていないか確認し、脳に髄膜がないことを確認します。
次に、頭蓋骨から3つの脳を抽出することから始めて、解剖のフルタイムは組織の保存と細胞の生存のために2時間以上かからないようにする必要があります。3つの脳の皮質を7ミリリットルのDounceホモジナイザーで6ミリリットルの冷解バッファーに移します。
続いて、クリアランスの大きい最初の乳棒で上下に10回ストロークして皮質を解離し、続いてクリアランスの小さい2番目の乳棒で上下に10回ストロークします。
次に、6ミリリットルの懸濁液を新しい50ミリリットルのFalconチューブに移し、24ミリリットルのコールド解剖バッファーでDounceホモジナイザーを洗浄します。懸濁液を3本のファルコンチューブに分割して、チューブごとに1つの皮質に相当します。
その後、室温で1000 x gで5分間遠心分離します。ペレットを観察すると、皮質のホモジネートの微小血管部分を表すピンク色のグラデーションが示されます。
次に、上清を廃棄し、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、DNase 1型、およびゲンタマイシンの混合物を含む1ミリリットルの酵素溶液で1つの皮質からペレットを均質化します。
チューブを摂氏37度のシェーカーに30分間入れます。次に、1ミリリットルの消化物と10ミリリットルの25%BSA / HBSS 1Xを混合し、チューブを穏やかにボルテックスします。続いて、室温で3,600 x g で15分間密度依存性遠心分離によってそれらを分離します。
密度依存的な遠心分離後、ペレットには微小血管が含まれ、上部椎間板にはミエリン、脳実質、および残存微小血管が含まれます。
上部ディスクと上清を清潔な50ミリリットルのファルコンチューブに慎重に移します。微小血管ペレットを吸引しないように注意してください。
チューブを穏やかにボルテックスし、密度依存の遠心分離を繰り返します。この2回目の遠心分離中、微小血管を含む得られたペレットを摂氏4度に保ちます。
2回目の密度依存性遠心分離後、上部ディスクと上清を慎重に廃棄します。両方の遠心分離からの微小血管を含む得られたペレットを1ミリリットルの冷たいHBSS 1Xと混合し、再懸濁します。
次に、20ミリリットルの冷たいHBSS 1Xで微小血管を洗浄し、1,000 x g で5分間遠心分離します。次に、微小容器ペレットを失わないように注意しながら、上清を廃棄します。
チューブの穏やかな渦に続いて、1つの皮質から1ミリリットルの同じ酵素溶液で微小血管ペレットを均質化します。さらに、微小血管をシェーカーで摂氏37度で1時間消化します。その後、3つの皮質から消化された微小血管を1つのチューブに混合します。
繰り返しになりますが、混合物を2本の50ミリリットルのファルコンチューブに分離して、チューブあたり1.5の皮質に相当する微小血管を取得します。次に、室温で1,000×gで5分間遠心分離します。
微小容器をプレーティングする直前に、インキュベーターからコーティングされたT75フラスコを2つ取り出し、余分なコーティングを吸引します。上清を廃棄し、マイクロベッセルペレットを1ミリリットルのECMに再懸濁します。
ピューロマイシン1ミリリットルあたり4マイクログラムを添加したECMで各チューブを10ミリリットルにして精製プロセスを開始し、フラスコに微小血管をプレートします。
次に、フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れて、コラーゲン-フィブロネクチンマトリックスへの微小血管の接着を可能にします。