JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 7:02 分 • April 30th, 2023
血液脳関門(BBB)は、内皮細胞やアストロサイトなどの脳細胞の選択的関門であり、血液と脳の間の物質の輸送を調節します。
BBBモデルを開発するには、メンブレンインサートを培養プレートの蓋に反転させます。
膜の上にアストロサイトを播種します。培養プレートをインサートの上に置き、インキュベートします。
これにより、膜とウェル表面の間にアストロサイトが閉じ込められます。
プレートを元に戻してアストロサイトを底に戻し、ウェルに適切な培地を追加します。
インサートに、バリア形成に必要な細胞間接触を強化する最適なタイトジャンクションタンパク質を発現する内皮細胞を追加します。
内皮細胞が膜に付着するようにインキュベートします。
使用済み培地を取り出し、インサートを別の十分に含有する成長因子を含まないアストロサイト培地に移します。
続いて、成長因子を含まない内皮細胞培地をインサートに加え、インキュベートします。
成長因子が存在しないと細胞分裂が阻害され、細胞間の接触が維持され、バリア特性が安定します。
内皮細胞と星状細胞は相互作用して、BBB のようなタイトジャンクションを持つ基底膜を形成します。
次に、神経膠腫スフェロイドを新しい培養井戸に播種します。
BBBモデルをこれらのスフェロイドに移し、インキュベートして血液脳腫瘍バリアまたはBBTBモデルを形成します。
標的分子をBBTBモデルに追加して、腫瘍部位への送達を評価します。
滅菌細胞培養フードの下で、培養した星状細胞を5ミリリットルの滅菌PBSで注意深く洗浄します。真空ポンプを使用してPBSをそっと廃棄し、2ミリリットルの細胞解離試薬を5分間加えて細胞を剥離します。
次に、10ミリリットルの滅菌完全星状細胞培養培地を容器に加え、細胞解離試薬の活性を阻害します。滅菌血清ピペットを使用して、剥離した細胞を血管から滅菌15ミリリットルチューブに移します。
室温で250 x gで3分間遠心分離します。その間に、インサートを設定します。滅菌鉗子を使用して、脳側を上にしてインサートを滅菌6ウェルプレートの蓋に置きます。
遠心分離が完了したら、細胞懸濁液から上清を慎重に廃棄し、アストロサイトペレットを1ミリリットルのABMプラスに再懸濁し、ペレットをチューブ壁に最大5回静かにピペッティングします。
次に、細胞をカウントし、細胞懸濁液密度をインサートあたり400マイクロリットルのABMプラスで150,000細胞に調整します。この細胞懸濁液をインサートの膜の脳側の中央に入れ、滅菌ピペットチップで毛細管現象を使用して慎重に広げます。
インサートの脳側を上にしたまま、6ウェルプレートをインサートに戻します。プレートとインサートを脳側を上にして、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れ、細胞の接着を可能にします。
この後、インサー
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