血液脳関門模倣透過性アッセイ:トレーサー分子に対するBBB模倣物の透過性を評価するためのIn vitroアッセイ

内皮細胞、周皮細胞、星状細胞で構成される血液脳関門 (BBB) は、生体分子の流入と流出を調節し、脳の恒常性の維持に役立ちます。

in vitro で BBB モデルの透過性を評価するには、多孔質膜インサートの上部または血液側に付着した内皮細胞と、膜の基底側または脳側に付着した星状細胞からなる in vitro BBB モデルから始めます。

細胞外マトリックスを持つ内皮細胞は星状細胞に接触し、BBB模倣を形成します。

最適な蛍光測定のために、血液側と脳側から必要な量の培地を黒色のマルチウェルプレートに移します。

培養物の血液側の培地を、低分子量蛍光トレーサー分子を含む培地に交換します。

培養では、内皮と星状細胞の接触が細胞バリアを強化し、タイトなバリアを安定させ、培養物の脳側へのトレーサー分子の拡散を制限します。

さらに、目的の時点で血液および脳側から適切な量の培地を収集します。両面をメディアに交換して、メディアのボリュームを維持します。

最後に、マルチウェルプレートリーダーを使用して収集した培地の蛍光を測定し、BBBモデルの透過性を評価します。

脳側からの蛍光強度が低いことは、細胞バリアの透過性が低いことを示唆しています。

まず、BBTB模倣体の血液側と脳側の両方から100マイクロリットルの培地を収集し、それぞれを別の平底の黒色96ウェルプレートに移して、その後の蛍光測定を行います。

次に、フルオレセインナトリウムの50マイクロモル溶液をEBMマイナスで調製し、ウェルあたり2.5ミリリットルを調製するようにします。溶液を摂氏37度に予熱し、インサートの血液側からの培地をこのフルオレセインナトリウム溶液を含む培地と交換します。媒体を交換したらすぐにタイマーを開始します。

インサートの血液側と脳側の両方から100マイクロリットルの培地を5分、30分、60分、120分で慎重に収集します。各サンプルを適切な黒色96ウェルプレートの別々のウェルに移します。プレートリーダーを使用して、収集したサンプルからの蛍光を定量します。