末梢血単核細胞(PBMNC)からの誘導神経幹細胞(iNSC)の生成:仙台ウイルスを用いたPBMNCsのiNSCへの再プログラム法

体細胞を誘導神経幹細胞(iNSC)に再プログラムするには、まず末梢血単核細胞を無血清培地で培養して赤芽球を増殖させます。

次に、赤芽球懸濁液を培養プレートにピペットで入れます。組換え仙台ウイルスまたはSeVで細胞を処理します。これらのウイルスは、転写因子の再プログラミングをコード化します。遠心分離して細胞を沈殿させ、インキュベートします。

宿主細胞膜へのSeV融合に続いて、ウイルスゲノムは転写を受け、続いて細胞質で翻訳されます。転写因子の異所性発現は、遺伝子を宿主ゲノムに組み込むことなく、細胞の再プログラミングプロセスを引き起こします。

次に、培養物を遠心分離してウイルスを除去します。形質導入された細胞を適切な培地に再懸濁し、続いてプレーティングを行います。さらに、遠心分離して細胞の破片を除去します。細胞をiNSC培地に再懸濁します。

いて、タンパク質でコーティングされたプレートに細胞を播種します。細胞はプレート内のタンパク質コーティングに付着します。接着した細胞に隔日でiNSC培地を補充します。1週間の培養後、使用済み培地を毎日新鮮なiNSC培地と交換します。

培地中の成長因子と化学成分は自己複製を維持し、形質導入された細胞のサブセットの多能性をサポートし、それらをiNSCに完全に再プログラミングします。時間が経つにつれて、細胞はiNSCコロニーを形成し始めます。培養するコロニーを選択します。

0日目に、細胞をMNC培地に集め、15ミリリットルのコニカルチューブに移します。細胞を200 x g で5分間遠心分離した後、上清を吸引し、1ミリリットルの予熱したMNC培地で細胞を再懸濁します。トリパンブルーで生細胞をカウントし、予熱したMNC培地で24ウェルプレートでウェルあたり200,000細胞の濃度に再懸濁します。

仙台ウイルスの入ったマイナス80°Cの貯蔵庫から取り出したチューブを37°Cの水浴で5〜10秒間解凍した後、室温で解凍します。解凍したら、すぐに氷の上に置きます。解凍した仙台ウイルスを、感染の多重度10でMNCを含む24ウェルプレートのウェルに加えます。細胞の付着を容易にするために、プレートを1,000 x g で30分間遠心分離し、その後、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。

1日目に、培地を含む細胞を15ミリリットルの遠心分離管に移します。残りの細胞をさらに分離するには、ウェルあたり1ミリリットルのMNC培地でウェルをすすぎ、培地を含む細胞をチューブに加えます。この細胞懸濁液を200 x g で5分間遠心分離した後、上清を吸引し、500マイクロリットルの新鮮な予熱MNC培地で細胞を再懸濁し、24ウェルプレートのウェルに加えます。

2日目に、以前に希釈した50マイクログラム/マイクロリットルのポリ-D-リジンとD-PBSのウェルあたり1ミリリットルを使用して、室温で少なくとも2時間6ウェルプレートをコーティングします。6ウェルプレートからポリ-D-リジンを吸引し、縦型クリーンベンチで約10分間乾燥させます。次に、以前に希釈した5マイクログラム/ミリリットルのラミニンをウェルあたり1ミリリットルを6ウェルプレートに加え、摂氏37度で4〜6時間インキュベートしてコーティングします。使用前にプレートをD-PBSで洗浄してください。

3日目に、すべての仙台ウイルス形質導入MNCを誘導神経幹細胞培地に、ポリ-D-リジンラミニンコーティングされた6ウェルプレートにプレートします。5日目と7日目に、1ミリリットルの摂氏37度の予熱したiNSC培地を6ウェルプレートの各ウェルにそっと加えます。

9日目から28日目まで、培地を毎日新鮮な予熱したiNSC培地と交換します。iNSCコロニーの出現を監視し、約2〜3週間で、燃やしたガラスピペットを使用して適切な形態を持つコロニーを選択します。次に、各コロニーを6ウェルプレートの別個のウェルに移して増殖させます。