MSC播種足場調製:マウスモデルへの外科的移植のための間葉系幹細胞播種足場を調製する技術

がん細胞は走化性ホーミング因子を産生して、間葉系幹細胞またはMSCを血管から腫瘍の位置に引き付けます。

細胞が腫瘍増殖に及ぼす影響をin vitroで研究するには、滅菌された足場基質を採取することから始めます。それを目的の培地を含むウェルプレートに移して、足場を事前に濡らします。乾燥した表面に置いて足場に付着している余分な培地を取り除き、細胞の接着性を高めます。部分的に乾燥した足場を新しい井戸に移します。MSC懸濁液を足場に一滴播種します。

さらに、ウェルの隅に培地を追加して、その後のインキュベーション中に液滴による培地の蒸発を防ぐ水和チャンバーを作成します。MSCが足場の表面に付着するようにインキュベートします。足場を裏返して、シードされていない表面を露出させます。こちら側にMSC懸濁液を新鮮に滴下し、MSCを付着させます。

MSCが足場の両側に付着したら、すべての細胞が培地と接触するように、より多くの培地で覆います。MSCが成長し、足場の隙間と細孔内に浸潤するまでインキュベートします。MSCシード足場は、外科的移植の準備が整いました。

マウスに移植する48時間前に、最初にPLA足場を約2 x 2ミリメートルの切除腔サイズの断片に切断することにより、足場を準備します。70%エタノールに15分間浸して足場を滅菌します。15分後、足場をPBSに浸します。次に、播種用の細胞を準備しながら、10%のウシ胎児血清と1%のペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾イーグル培地に足場を置きます。

細胞を調製するには、まず、0.05%トリプシンを使用して培養したMSCを持ち上げます。摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞が持ち上げられていることを確認します。次に、フラスコにDMEMを加えてトリプシンを不活性化します。次に、フラスコの内容物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、100 x g で 5 分間遠心分離することにより、各足場の 5 番目の MSC に 5 回 10 回ペレットします。

遠心分離に続いて、上清を吸引し、MSCを5回10回あたり5マイクロリットルのDMEMに5番目の細胞に再懸濁します。次に、鉗子でDMEM浸漬から足場を取り外し、6ウェルプレートの蓋の上に置きます。足場を蓋から持ち上げて、余分なDMEMの液滴を残します。足場を新しい乾燥した場所に再び蓋に戻します。3〜5回繰り返します。次に、部分的に乾燥した足場を新しい6ウェルプレートに入れて播種します。

部分的に乾燥した足場は、最適な細胞播種結果を提供します。足場が湿りすぎると、細胞が足場から滑り落ちて下のプレートに付着します。足場を乾燥させると、液滴が足場全体に広がらず、初期細胞分布が悪くなります。

ピペットを使用して、一部の細胞が底に沈殿している可能性があるため、MSCのチューブを穏やかに混合して懸濁液を均質化します。2.5マイクロリットルの混合したばかりのMSC懸濁液を足場に直接ゆっくりとピペットで入れ、足場の上部に小さな液滴を作ります。細胞滴の急速な蒸発を防ぐために、各ウェルの端に300マイクロリットルのDMEMを追加します。摂氏37度で30分間インキュベートし、細胞を足場に付着させます。

インキュベーション後、鉗子を使用してウェルプレート内の足場をそっと裏返します。2.5マイクロリットルの新たに混合されたMSC懸濁液を播種し、足場ごとに播種された5番目の細胞に合計5回10を与えます。細胞が足場に付着するように30分間インキュベートした後、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを加えて、DMEMで足場を覆います。足場をゆっくりと持ち上げて、媒体が足場の下に流れるようにします。移植手術の前に、この状態で摂氏37度で48時間インキュベートします。