神経膠腫細胞の蛍光標識:深部組織イメージングのための蛍光タンパク質を発現する神経膠腫細胞を得るためのレンチウイルスベクターベースのトランスフェクション法

in vivo 脳腫瘍イメージングでは、蛍光標識されたがん細胞をマウスの脳に注入して腫瘍の発生を観察します。蛍光標識の場合は、神経膠腫細胞をレンチウイルス粒子とインキュベートします。レンチウイルスベクターは、赤外蛍光タンパク質の遺伝子iRFPを運びます。

ウイルスは神経膠腫細胞表面に結合し、RNAを細胞内に放出します。細胞酵素はウイルスRNAを二本鎖DNAに変換し、二本鎖DNAが細胞ゲノムに組み込まれ、iRFP発現を可能にします。iRFPの励起と発光の最大値は、組織の吸光度と散乱が最小限の近赤外領域内にあります。これにより、正確な深部組織イメージングが可能になります。

次に、使用済み培地を取り除き、トリプシンを加えます。プロテアーゼ酵素であるトリプシンは接着タンパク質を消化し、フラスコ表面から細胞を剥離します。ピペットを繰り返して個々の細胞を分離します。細胞懸濁液をチューブに集めて遠心分離します。次に、ペレットを再懸濁するための適切なバッファーを追加します。

細胞懸濁液をフローサイトメトリーチューブに分注し、蛍光色素DAPIで細胞を染色します。DAPIは死んだ細胞の核を明るい青色に染色し、生きた細胞と区別します。蛍光活性化セルソーターまたはFACSを使用して、蛍光に基づいて生きたiRFP陽性細胞を他の細胞集団から選別します。単離された細胞は、腫瘍イメージングのためにマウスに注射するために使用できます。

まず、5ミリリットルの培地に10〜6番目の神経膠芽腫細胞を10センチメートルの皿に播種し、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。翌朝、5の感染倍数で目的の適切な蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスで細胞を形質導入し、細胞をインキュベーターに戻します。

24時間後、上清を5ミリリットルの新鮮な培地と交換し、培養物をさらに48時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、培地を摂氏37度で10〜15分間3〜5ミリリットルのトリプシンと交換し、その後、分離した細胞を完全に解離させるために慎重にピペッティングします。

遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを500マイクロリットルの選別溶液に再懸濁します。細胞を適切な数のFACSチューブに分割し、死細胞を除外するためにDAPIで細胞をコステインします。次に、チューブをフローサイトメーターにロードし、蛍光コンストラクトの発現に従って生細胞を新鮮な選別溶液を含む15ミリリットルの円錐形チューブに選別します。

遠心分離後、コンストラクト陽性/DAPI陰性細胞を5ミリリットルの培地に再懸濁し、摂氏37度で48〜72時間培養するために新しい10センチメートルの皿に播種します。インキュベーションの最後に、播種用の細胞を複数の皿に分割して、その後のin vivo実験を行います。