JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 4:15 分 • July 8th, 2025
脳腫瘍幹細胞 (BTSC) は、脳腫瘍細胞の亜集団であり、腫瘍の増殖と転移を開始する可能性があり、がん治療の有望な標的となっています。in vitro での BTSC 遊走に対する薬物の効果を研究するには、まず、適切な培地中で BTSC の均一な懸濁液を調製します。懸濁液の1つを目的の薬物で処理します。
一方、各ウェルを上部チャンバーと下部チャンバーに分離する膜インサートからなるマルチウェル走化性プレートを入手します。ピペットで所望の細胞外マトリックスタンパク質を下部チャンバーと膜インサートに移植しました。タンパク質の重合を促進するためにインキュベートします。
所望の化学誘引剤を含む適切な基礎培地を下部チャンバーに加え、膜状インサートの上に置きます。次に、薬物処理および未処理のBTSC懸濁液を膜状インサートに播種します。生細胞顕微鏡を使用してプレートを長時間画像化します。
培養では、BTSCはインサートのタンパク質マトリックスに付着します。上部チャンバーと下部チャンバーの間に確立された化学誘引剤濃度勾配に応答して、未処理のBTSCは、メンブレンインサート細孔を通ってタンパク質マトリックスを横切って下部チャンバーに移動します。
しかし、薬物治療は細胞の機能活性に悪影響を及ぼし、BTSC 遊走を減少させます。次に、適切なソフトウェアを使用して、下部チャンバーで移動したBTSCを分析および定量します。未処理のBTSCは移動の増加を示し、薬物処理されたBTSCは移動の減少を示します。
遊走に対する目的の薬物処理の効果を評価するには、まず、適切な実験期間、適切な濃度の薬物で細胞を前処理します。走化性プレートを調製するには、96ウェル走化性プレートの条件ごとに3つの膜インサートウェルと3つの底部リザーバーウェルを、それぞれ75マイクロリットルおよび225マイクロリットルの0.2ミリグラム/ミリリットルのI型コラーゲンで、摂氏37度で1時間コーティングします。
インキュベーションの最後に、コラーゲンコーティングを傷つけずに各ウェルからコラーゲン溶液を吸引し、ウェルを滅菌PBSで2回洗浄します。最後の洗浄後、プレートからインサートを取り外し、10%FBSを添加した225マイクロリットルの成長因子フリー培地を走化性プレートの各底部リザーバーウェルに加えます。
次に、上部のインサートを下部のリザーバーに斜めに静かに戻して気泡の発生を避け、50マイクロリットルの成長因子フリー培地中の3番目の解離したBTSCに2.5倍10を各インサートウェルに加えます。BTSCを単一細胞に完全に解離させ、細胞の塊や上部インサートに細胞が多すぎないように、プレーティング前に慎重にカウントすることが重要です。
FBS勾配に沿ったBTSCの移動を画像化するには、プレートを生細胞イメージングシステムに入れ、最大72時間、1〜2時間ごとにプレートの顕微鏡画像を取得するように自動イメージングソフトウェアを設定します。画像取得が完了したら、新しい処理定義を選択して、BTSCをメンブレンの底面の挿入孔から区別し、必要に応じて細胞をバックグラウンドメンブレンから正確に区別できない場合は分析を変更します。
細孔を通って移動した細胞を定量化するには、条件ごとの3つの複製ウェルのそれぞれについて、膜の底側の細胞表面積としてデータを収集します。次に、時間の経過とともに移動した細胞の面積をマイクロメートルの2乗で移動させるとして、細胞移動をグラフ
化します。