脳腫瘍幹細胞(BTSC)ニューロスフェア侵襲アッセイ:ニューロスフェアからのBTSC浸潤に対する薬物治療の効果を分析するためのインビトロアッセイ

脳腫瘍幹細胞 (BTSC) は、脳腫瘍内の細胞のサブセットであり、自己複製能力を持ち、腫瘍の進行と治療抵抗性に寄与します。in vitroでのBTSC浸潤に対する薬物の効果を判断するには、培養フラスコ内の適切な培地中のBTSC懸濁液から始めます。懸濁液の1つを目的の薬物で処理します。

フラスコをインキュベートします。培地成分は細胞増殖を促進します。細胞は浮遊状態のままであり、それによってニューロスフィアと呼ばれる球状のクラスターを形成します。希望のサイズに達したら、神経球を集めます。重力によって沈殿させ、媒体を除去します。次に、未処理および薬物処理された神経球を、適切な細胞外マトリックスタンパク質と薬物を含む冷却培地に再懸濁します。

懸濁液をチルドマルチウェルプレートにプレートします。より良いイメージングのために、神経球を井戸の底に沈殿させます。次に、マトリックスタンパク質重合のためにインキュベートし、その中に神経球を埋め込みます。生細胞顕微鏡を使用して、神経球を長時間画像化します。培養では、埋め込まれたBTSCはタンパク質分解酵素を分泌し、マトリックスタンパク質を分解し、細胞遊走を可能にします。

時間が経つにつれて、マトリックスの分解が増加すると、神経球から周囲のマトリックスへのBTSCの侵入に適した微小環境が作成されます。適切なソフトウェアを使用して、さまざまな時点での神経球の総表面積を測定します。未処理の BTSC は表面積の増加を示し、薬物処理された BTSC よりも浸潤率が高いことを示しています。

BTSC 神経球浸潤を評価するには、まず、神経球浸潤プレーティング前の所定の時間経過の間、目的の化合物を所望の濃度でフラスコに加えます。平均神経球サイズが約150〜200マイクロメートルに達したら、フラスコをピペットで傾けてそっと混合し、氷上の実験条件ごとに500マイクロリットルの再懸濁BTSC神経球を1本の1.5ミリリットルチューブに移します。

神経球ペレットを失うことなく、各1.5ミリリットルチューブの底からできるだけ多くの培地を吸引し、神経球を500マイクロリットルの新しく調製された0.4ミリグラム/ミリリットルのI型コラーゲン溶液に穏やかに再懸濁します。100マイクロリットルのコラーゲン懸濁神経球を条件ごとに3つのウェルに、氷上の新しい96ウェルプレートに移し、神経球を5分間沈降させます。

神経球が氷上で5分間落ち着くようにすることが重要です。そうしないと、球体はイメージングの同じ焦点面上にありません。細胞培養インキュベーターで5分間コラーゲン重合した後、プレートを生細胞イメージングシステムのトレイに移して、浸潤が始まる前にプレーティング時の神経球サイズの基準画像を取得します。次に、侵入速度が頭打ちになるまで、通常は24時間ごとに1〜2時間ごとに