JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 4:13 分 • July 8th, 2025
神経膠芽腫は、有髄ニューロンの軸索路に沿って移動して脳の遠くの場所に侵入する幹細胞様細胞を持っています。in vitroでニューロン上の神経膠芽腫またはGBM細胞の移動を要約するには、ガラスカバーガラスを採取することから始めます。
酸素プラズマ処理によりカバーガラスを活性化し、官能化剤でプライミングします。この処理により、後続のステップで化学物質に簡単にアクセスできるようになります。PEG化溶液をカバーガラスに加え、インキュベートします。この溶液はカバーガラスをコーティングし、ランダムな場所でのニューロンの癒着を防ぎます。
光開始剤ポリマーをカバーガラスに分注し、イメージングチャンバーに取り付けます。チャンバーを蛍光顕微鏡のステージに置きます。内部に入ると、UV照明は、想定されたマイクロパターンに対応する指定された領域で光開始剤分子を局所的に活性化します。
活性化された光開始剤分子は下にある PEG 層を切断し、目的のパターンを生成します。次に、ラミニン溶液を加えてインキュベートします。糖タンパク質であるラミニンは、PEG層が除去された特定の場所に沈着します。ラット海馬ニューロンを含む培地をカバーガラスに播種します。
インキュベートして、ニューロンをラミニンでコーティングされたアレイに接着させ、ニューロンのマイクロパターン化されたカバーガラスを取得します。蛍光標識されたGBM細胞の懸濁液をマイクロパターン化されたニューロンの上に沈着させます。ニューロン上を移動する蛍光GBM細胞を見るための画像。
マイクロパターニング用の基板を作成するには、18 mmの円形ガラスカバーガラスを空気またはプラズマ活性化によって5分間処理してから、カバーガラスを100マイクロリットルの3-アミノプロピルトリエトキシシランを含むデシケーターに1時間置きます。次に、Peg-SVAの溶液を100ミリグラム/ミリリットルで1時間インキュベートしてゲル堆積させます。インキュベーションの最後に、3マイクロリットルのPLPPと50マイクロリットルの無水エタノールをスライドの中央に加え、完全に乾くまで待ちます。
スライドガラスのマイクロパターニングの場合は、カバーガラスをルーディンチャンバーに取り付け、オートフォーカスシステムを備えた顕微鏡のステージにチャンバーを置きます。イメージング後、マイクロパターン化された画像をソフトウェアにロードします。自動UV照明シーケンス後、ピペットを使用してカバーガラスからPLPPをPBSで広範囲に洗浄します。次に、カバーガラスを1ミリリットルあたり50マイクログラムのラミニンと30分間インキュベートし、続いて示されているようにPBSでもう一度洗浄します。
マイクロパターンのカバーガラス上に胚ラット海馬ニューロン培養物を設定するには、最後の洗浄後、スライドガラスをニューロン細胞培養培地で再水和します。1平方センチメートルあたり3%のウマ血清が豊富な神経基礎培地に懸濁した4番目のラット海馬ニューロンを、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターで24時間インキュベートするために、各マイクロパターンカバーガラスに5回10回播種します。解離した神経膠芽腫細胞を1,000rpmで5分間遠心分離し、ペレットを神経膠芽腫細胞培養培地に再懸濁します。次に、マイクロパターン化されたニューロンの上に3番目のGBM細胞に10倍10を沈着させます。