初代脳周皮細胞の単離と培養:内皮細胞汚染なしにウシ脳毛細血管から周皮細胞を単離および培養する手順

中枢神経系では、周皮細胞は毛細血管の内層を形成する内皮細胞を包み込む多機能細胞です。周皮細胞は血流を調節し、脳の恒常性を維持するのに役立ちます。

周皮細胞を分離するには、まず冷凍ウシの脳毛細血管をバイアルに入れます。解凍後、内容物を目的の培地の入ったチューブに移します。遠心分離機で毛細血管をペレット化します。凍結培地を含む上清を取り除きます。キャピラリーペレットを培地に再懸濁し、懸濁液を細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたフラスコに播種します。

毛細血管がフラスコ内のコーティングに付着するようにインキュベートします。培地をヘパリン含有培地に交換します。培養では、細胞外マトリックスタンパク質コーティングは周皮細胞が毛細血管断片から遠ざかって増殖するように促し、ヘパリンは内皮細胞の遊走を刺激します。

使用済み培地をヘパリン含有培地と交換します。時間が経つにつれて、周細胞はフラスコに強く付着する細長い突起を投影します。基質空間が限られていると、内皮細胞は増殖し、接触阻害された単層を形成します。適切な周皮細胞密度に達したら、培地を取り除き、フラスコをバッファーで洗浄します。

トリプシン-EDTAを使用して、緩く結合した内皮細胞をフラスコから切り離します。続いて、トリプシン-EDTA活性を中和する培地を追加します。培地で繰り返し洗浄して、剥離した内皮細胞を除去します。培地を追加し、周皮細胞がフラスコに付着したままであることを確認します。周皮細胞が豊富な培養物をインキュベートして増殖させます。

摂氏37度の水浴で毛細血管のバイアル1本を解凍します。毛細管が解凍したら、30ミリリットルのDMEM-compを入れた遠心分離管に移し、500 x gで5分間遠心分離します。次に、チューブから培地を取り出し、ペレットを10ミリリットルの新鮮なDMEM-compに再懸濁します。懸濁液をコーティングされたT75フラスコに移し、10%の二酸化炭素を供給する摂氏37度のインキュベーターでキャピラリーを4〜6時間底に付着させます。インキュベーション後、光学顕微鏡でフラスコを検査します。

細管の画分をフラスコの底に取り付ける必要があります。4日目に、毛細血管を播種した後、顕微鏡で検査し、約60%から70%がコンフルエントであることを確認します。培地を吸引し、PBSで細胞を穏やかに洗浄します。2ミリリットルの解凍したトリプシン-EDTAを加え、フラスコをインキュベーターに1〜3分間放置し、フラスコを頻繁に取り出し、顕微鏡で細胞の剥離を観察します。内皮細胞が丸まり始めたら、フラスコを軽くたたいて剥がします。

細胞が剥離したら、フラスコに10ミリリットルのDMEM-compを加えてトリプシン処理を停止します。フラスコを培地で数回洗い流し、内皮細胞懸濁液を吸引すると、他の目的に使用できます。フラスコに10ミリリットルのDMEM-compを加え、光学顕微鏡で確認して、周皮細胞がまだ存在し、底に付着していることを確認します。次に、フラスコをインキュベーターに戻して、周皮細胞が豊富な培養物を増殖させます。