ヒト脳からの脳毛細血管の単離:ヒト脳組織から脳毛細血管を抽出するための最適化法

脳毛細血管は、血液脳関門の重要な構成要素であり、血液と脳の間の溶質の選択的移動を可能にする半透性バリアです。脳毛細血管を分離するには、新鮮なヒトの脳組織から始めます。髄膜を取り除き、白質を切り取ります。

脳組織を細かく刻みます。フラグメントを適切なバッファーを含むホモジナイザーに移し、ホモジナイズします。均質化により組織が崩壊し、毛細血管や組織の破片が溶液中に放出されます。

ホモジネートを新しいチューブに移し、適切な密度勾配培地の最適な容量を追加します。溶液を遠心分離して毛細血管をペレット化します。密度勾配媒体が多すぎたり少なすぎたりすると、毛細管収率が低くなります。上清を取り除きます。

ペレットをウシ血清アルブミンまたはBSAを添加したバッファーに再懸濁します。BSA は消化酵素を安定させ、毛細血管の構造的完全性を維持します。次に、溶液を適切なフィルターでろ過し、大きな血管や組織の破片を除去します。

次に、濾液を小さなメッシュフィルターに通します。このフィルターは大脳毛細血管を保持し、小さな破片や赤血球を通過させます。その後、フィルターを裏返し、BSAを添加したバッファーを入れた新しいチューブで毛細血管を洗い流します。

溶液を遠心分離し、上清を除去します。純粋な毛細血管をバッファーに再懸濁し、さらに使用するために保管します。

この手順を開始するには、約10グラムの人間の脳組織の重量を記録します。顕微鏡下で、鉗子ですべての髄膜を慎重に取り除き、メスを使用して白質を切り取ります。次に、脳組織を慎重に切り刻み、メスで約5分間みじん切り

にします。

脳組織を組織グラインダーに移し、30ミリリットルの単離バッファーを追加します。続いて、各サンプルを50rpmで100ストロークで均質化します。気泡を防ぐため、空気中でかき混ぜないでください。25ストロークごとの時間と100ストロークに必要な合計時間を文書化します。その後、ホモジネートを氷上のDounceホモジナイザーに移します。懸濁液を約20ストローク均質化し、気泡を避けます。

次に、脳ホモジネートを4本の50ミリリットル遠心分離チューブに均等に分配し、ホモジネートの総量を記録します。Ficoll の正しい量を追加してください。Ficollが少なすぎたり多すぎたりすると、毛細血管を細胞破片から分離するための密度が正しくなくなり、毛細管ペレットが減少し、収量が制限されます。

10ミリリットルの分離バッファーを使用して乳棒とホモジナイザーをすすぎ、4本の遠心分離チューブに分配します。次に、50ミリリットルの密度勾配バッファーを遠心分離チューブに分配します。遠心分離管をキャップでしっかりと閉じます。その後、チューブを激しく振ってホモジネート、密度勾配培地、およびバッファーを混合します。摂氏4度で5,800 x gで15分間遠心