子宮内エレクトロポレーションに基づく遺伝子導入:マウス胚の胚性小脳細胞にプラスミドDNAを注入する技術

仰

臥位に置かれた妊娠中の麻酔をかけた雌マウスモデルを取り出すことから始めます。腹部から毛を取り除いてマウスを準備します。皮膚とその下の筋肉層を切開して、生存可能な胚をホストする部位である子宮角を露出させます。

次に、子宮の角を腹腔から引き抜きます。目的のプラスミドDNA溶液を含む鋭い先端ガラスキャピラリーを取ります。胚の脳を見つけ、プラスミドDNA溶液を子宮壁を通して第4脳室に注入します。この位置は、小脳原基の前方にあり、最終的なDNA送達のための望ましい場所です。

注射後、空の毛細血管を引っ込めます。次に、DNA注入胚のエレクトロポレーションのために、正極が小脳原基を覆い、負極が耳の周りの領域を覆うように、2つの電極を子宮壁の上に配置します。

電気パルスを所望の時間印加します。これらのパルスは小脳ニューロン細胞を透過性にし、プラスミドDNAが標的細胞に入ることを可能にします。最後に、子宮角を腹腔内の自然な位置に戻します。切り傷を縫合し、マウスをケージに移し、回復させます。

まず

、ホウケイ酸ガラスの毛細管をマイクロピペットプーラーにロードし、引っ張って細いチップを作成します。キャピラリーチップに黒インクでラベルを付けて、注入中の視覚化を良くし、ガラスにスケーリングを描きます。実体顕微鏡下で作業し、定規と鋭利な針ピンセットを使用して先端を約6ミリメートルの長さにトリミングし、鋭い片側の面取りされたエッジを作成します。

1%ファストグリーンストック溶液を0.22ミクロンのフィルターでろ過し、溶液から色素粒子を除去します。シングルガイドRNAプラスミドをルシフェラーゼレポータープラスミドと等量で混合し、各プラスミドについて少なくとも1マイクログラム/ミリリットルの最終濃度にします。

血漿溶液を最終濃度0.05%のファストグリーンで着色します。妊娠中のCD-1マウスをイソフルランで麻酔した後、マウスを加熱パッドの上に仰向けに置き、鎮痛剤を投与します。手術中の目の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗ります。手足をテープで固定し、腹部を消毒剤で滅菌します。

マウスをガーゼで覆い、手術領域だけを露出させます。長さ約2センチメートルの皮膚切開を行った後、白線の位置を特定し、鈍い先端の組織はさみを使用して、腹膜を通る少し小さな2番目の切開を行います。開いた腹腔を予熱した滅菌PBSで湿らせます。

次に、リング鉗子を使用して、腹腔から子宮角を慎重に抽出します。隣接する2つの胚の卵黄嚢の間の隙間で子宮壁をつかみ、そっと引っ張ります。胚を切開部から引っ張るときは、胚に圧力がかからないようにしてください。子宮角が抽出されたら、準備したガラス毛細管で約10〜15マイクロリットルの着色プラスミド溶液を吸引します。このプロセス中は気泡が出ないようにしてください。

リング鉗子で胚をそっと持ち、首の部分を見つけます。ガラス毛細血管の先端で背側後脳をゆっくりと貫通し、第4脳室に移動します。約1マイクロリットルのプラスミドミックスを注入します。染色されたDNAが脳から漏れておらず、ひし形の構造として見えることを確認します。

ここでは、小脳原基の遠位部分にもDNAを送達するために、第4脳室の領域全体をプラスミド溶液で満たすことが最も重要です。同時に、その過程で出血を引き起こさないように注意してください。

直径5ミリメートルの電極板を備えたプラチナピンセットを胚の頭の上に横方向に置き、負極を耳を覆い、正極を子宮壁上の小脳原基に配置し、電気方形パルスを印加します。

すべての胚がエレクトロポレーションされたら、子宮の角を慎重に腹腔に戻し、滅菌PBSで満たします。子宮角を自然な位置に滑らせます。麻酔をオフにし、動物の腹を下にして新しいケージに入れて回復します。