ゼブラフィッシュ胚への腫瘍細胞の長期同所性移植:ゼブラフィッシュ胚の第4脳室に腫瘍細胞を送達する効率的な方法による腫瘍細胞の挙動の長期解析

同所性移植では、腫瘍細胞または腫瘍担保ドナーの組織が、同じ種のレシピエントの対応する組織に移植されます。まず、腫瘍を担保するゼブラフィッシュから採取した蛍光標識脳腫瘍細胞の均一な懸濁液を適切な緩衝液で調製します。細かいゲルローディングチップを使用して、この細胞懸濁液をマイクロインジェクション針にロードします。

次に、ロードされた針をマイクロマニピュレーターのホルダーに固定します。続いて、麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚をプレハブの注射プレートに移します。マイクロインジェクション中に簡単にアクセスできるように、胚を横方向に配置して、脳内にある脳脊髄液で満たされた空洞のネットワークである脳室を視覚化します。

針の先端を調整して、腫瘍細胞懸濁液を胚の後脳のひし形の空洞である第4脳室に注入します。腫瘍細胞は心室内の中空空間を占めます。針を引っ込めます。胚を生理食塩水を含む培養皿に移します。蛍光実体顕微鏡で胚を観察し、心室空間内に腫瘍細胞が存在することを確認します。

胚をインキュベートします。注射から数時間以内に、腫瘍細胞は移動して周囲の脳組織に侵入し、そこで増殖して新しい腫瘍を引き起こします。時間が経つにつれて、腫瘍細胞は増殖してさらに浸潤し、脳全体に広がります。

トランスファーピペットを使用して、10〜20個の麻酔胚を注入プレートの周辺に移します。胚は、心室がはっきりと見え、アクセス可能な状態で横方向に落下する必要があります。角度の付いたプローブを使用して、必要に応じて胚を調整し、注入プレートの外縁から離して配置します。

次に、ゲルローディングチップを使用して、1〜2マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液を注射針にロードし、針をマニピュレーターに挿入します。次に、針を45度の角度で持ちながら、手動でマニピュレーターを下げます。マイクロマニピュレーターのノブをx、y、z方向に調整し、針が胚頭のすぐ上、右側約5ミリメートルになるまで調整します。

実体顕微鏡を使用して、針が胚の第4脳室を貫通するまで、マイクロマニピュレーターをx方向にゆっくりと調整します。針が心臓や卵黄を突き刺さらないようにしてください。一貫した注射を行うには、胚を麻酔する必要があります。腫瘍は細胞懸濁液に適切に解離する必要があり、針は第4脳室を貫通する必要がありますが、心臓を超えて伸びてはなりません。

マイクロインジェクターのフットペダルを押して、腫瘍細胞懸濁液を注入します。注射が終了したら、新鮮な卵水を使用して、注入された胚を注射プレートからペトリ皿にそっとすすぎます。次に、注入された胚を暗室の蛍光実体顕微鏡下で検査します。注射圧力、角度、針のサイズ、および細胞懸濁液の粘度により、腫瘍細胞が心室空間の25%から50%を満たすことを確認します。

胚を摂氏28度のインキュベーターに一晩戻します。翌日、前述のよう