マウスモデルにおける治療用神経幹細胞(NSC)の鼻腔内送達:腫瘍溶解性ウイルスをロードしたNSCの脳腫瘍担持マウスモデルへの腫瘍標的送達の手順

まず、神経幹細胞またはNSCの培養物を低酸素条件にさらします。このプレコンディショニングにより、NSC 増殖と腫瘍標的化能力の強化が促進されます。次に、NSCを回収し、条件付き複製腫瘍溶解性ウイルスの所望の濃度で処理します。インキュベートしてウイルスを細胞にロードします。

次に、培養物を遠心分離して、結合していないウイルスを除去します。ウイルスをロードしたNSCを適切なバッファーに再懸濁します。一方、麻酔をかけた脳腫瘍を保有マウスを仰臥位に置き、鼻孔へのアクセスを容易にします。ウイルスをロードしたNSCをマウスの各鼻孔に、短い間隔で繰り返し慎重に投与します。

マウスが回復するまで待ちます。鼻腔内に鼻腔内投与されたNSCは、血液脳関門を迂回して脳に入ります。脳内では、ウイルスはこれらの事前調整された細胞内で複製され、腫瘍部位に移動し、免疫系から身を守ります。時間が経つにつれて、NSCから放出されたウイルス粒子は相互作用し、腫瘍細胞で過剰発現した特定の細胞表面受容体に結合します。

ウイルスの内在化後、これらの条件付き複製ウイルスは腫瘍細胞内で優先的に複製され、細胞溶解を引き起こします。溶解された腫瘍細胞はウイルス粒子を放出し、周囲の腫瘍細胞に感染し、感染と腫瘍細胞溶解のカスケードを引き起こします。細胞溶解により腫瘍抗原が露出し、腫瘍細胞に対する免疫応答が活性化されます。

ヒト神経幹細胞に腫瘍溶解性ウイルスをロードするには、標準的なアデノウイルストランスフェクションプロトコルに従って、細胞あたり50の条件付きアデノウイルスウイルス粒子の条件付き複製で幹細胞に感染させ、室温で2時間定期的にタッピングします。次に、細胞を新鮮な培地で3回洗浄して、結合していないウイルス粒子を除去し、鼻腔内送達のために細胞を滅菌生理食塩水に懸濁します。

細胞が実験的に適切に修飾されたら、麻酔をかけた担腫瘍動物をヒートパッドの上の清潔なドレープの上に仰臥位に置き、頭の下にパッド入りの枕を置き、鼻孔を直立角度に保ちます。枕の素材は、交雑動物の汚染を避けるために、アルコールで拭き取れるプラスチックまたは使い捨ての丸めたペーパータオルのいずれかである必要があります。

マウスが所定の位置に着いたら、マイクロピペットを使用して、目的の実験的ヒト神経幹細胞集団2マイクロリットルを最初のマウスの各鼻孔に分注し、次のボリュームの細胞を適用する前に液滴の吸引を視覚的に確認します。各マウスに順番に配信を繰り返します。次に、5分間待ってから、次のセルを適用します。細胞の4ラウンドすべてが投与されたら、完全に回復するまで監視しながら動物を回復チャンバーに入れます。