微小腫瘍の生成:薬物治療に対する反応を解析するための3D微小腫瘍を培養するIn vitro培養技術

微小腫瘍 (3 次元 in vitro 腫瘍細胞凝集体) は、in vivo 腫瘍微小環境を厳密に模倣しており、薬効を評価するための有望なプラットフォームとして機能します。微小腫瘍を生成するには、患者由来の腫瘍細胞を均一に懸濁することから始めます。

次に、細胞懸濁液を、冷却したヒト由来の細胞外マトリックスまたはECMの所望の容量で希釈します。この細胞マトリックス混合物を少量のピペットで、疎水性コーティングを施したピンを含むカスタマイズされた金属プレートにピペットで移動します。ピンの疎水性コーティングにより、液滴は球形を維持できます。

ECMのゲル化を促進し、細胞を内部に埋め込むためにインキュベートします。次に、細胞包埋ゲルビーズを適切な培地を含む大容量培養プレートに移します。所望の期間インキュベートします。培養では、カプセル化された細胞が ECM マトリックス内で凝集し始め、刺激されていない細胞増殖のための環境を提供します。

さらに、培地成分はマトリックスを拡散して細胞増殖を促進し、ビーズ内に三次元微小腫瘍の形成を促進します。続いて、微小腫瘍を含むビーズを培地を含むマルチウェルプレートに移します。1セットの微小腫瘍を目的の薬剤で治療し、インキュベートします。

隔週で培地と薬液で微小腫瘍を補充します。生細胞イメージングにより微小腫瘍の細胞形態を決定します。未治療の微小腫瘍は継続的な増殖を示しますが、薬剤感受性微小腫瘍は増殖の抑制を示します。

微小腫瘍を生成するには、解離した患者由来の神経膠芽腫異種細胞をスピンダウンし、FBS 2マイクロリットルあたり50,000細胞でペレットを再懸濁します。次に、氷冷の高密度ヒトバイオゲルで細胞を1〜4の細胞対バイオゲルの比率で希釈します。次に、電子マルチチャンネルピペットを使用して、ピンあたり10マイクロリットルのセル混合物を疎水性コーティングを施した96ピン鋼板に分注します。

細胞、培地、バイオゲルを混合するときに気泡を防ぐと同時に、ヒトバイオゲルがピン上で固まり始める前に微小腫瘍を生成するために迅速かつ効率的に作業することが重要です。

すべての腫瘍がプレーティングされたら、3D腫瘍を組織培養インキュベーターに20分間移して、腫瘍ビーズをゲル化します。インキュベーションの最後に、微小腫瘍を完全な神経基底培地を含む10センチメートルの培養皿に移し、腫瘍をインキュベーターに戻します。

1〜2日後、広口分注ピペットを使用して、ウェルあたり50マイクロリットルの神経基底培地を含む96ウェル培養プレートのウェルに微小腫瘍を移し、各ウェルに50マイクロリットルの適切な投与溶液を加えます。処理された微小腫瘍を組織培養インキュベーターで1〜14日間維持し、週に2回、腫瘍に新鮮な培地と薬液を与えます。