SB媒介転位を用いた膠芽腫誘導:トランスポゾンを介したSBプラスミドの新生児マウス脳への統合を用いた新規マウスモデル作製技術

プラスミドの混合物を含むチューブを取ります。眠れる森の美女またはSBトランスポゾンプラスミドは、2つの逆反復配列の間に挟まれたヒト由来の神経膠芽腫誘発癌遺伝子を含む転移因子を運ぶように設計されています。さらに、このミックスには、トランスポザーゼ酵素発現要素を有するSBトランスポザーゼプラスミドが含まれています。

次に、適切なトランスフェクション試薬をチューブに追加します。マイクロニードルが取り付けられたシリンジに注射混合物を吸引します。次に、麻酔をかけたマウスの子犬を定位固定フレームに腹臥位に固定します。子犬の頭の領域を視覚化して、頭蓋縫合糸の位置を特定します。マイクロニードルを頭蓋縫合糸の上に配置します。

混合物を側脳室 - 脳実質内の空洞 - に注入します。その後、溶液は脳実質に分散され、そこでトランスフェクション試薬分子が細胞内のプラスミドの侵入を促進します。細胞内に入ると、トランスポザーゼプラスミドはトランスポザーゼ酵素分子を発現し、逆反復配列を認識し、トランスポゾン要素を切除します。

、転移因子DNAは、子犬のゲノムDNAのTAリピート領域に再統合されます。遺伝子転位は脳細胞の発癌性形質転換を引き起こし、マウス脳に神経膠芽腫の発症につながります。

実験の3〜4週間前に、オス1匹とメス1匹のマウス繁殖ケージを設置します。環境を豊かにし、交尾の可能性を高めるために、色付きのプラスチック製のイグルーを含めます。妊娠が確認されたらオスを取り除き、交尾日から18日後に、出産のためにメスの監視を開始します。出産前後に代理母がいることを確認してください。

生後1日目に脳室内注射を行います。トランスポゾンプラスミドを含むDNAミックス20マイクロリットルを、マイクロリットルあたり0.5マイクログラムのDNAの最終濃度で最初に分注することにより、注射液を調製します。次に、20マイクロリットルのPEI溶液をDNA溶液に加え、室温で20分から1時間インキュベートした後、混合物を氷上に保存します。

注射針の場合は、10 度に面取りされた 30 ゲージの皮下注射針に 12.5 マイクロリットルの注射器を取り付けます。次に、自動注入でシリンジをポンプに取り付けます。10マイクロリットルの水でセットアップをテストし、必ずシリンジを空にしてください。次に、新生児の定位固定期をドライアイスとアルコールのスラリーで冷却します。摂氏2〜8度に冷却されたら、注入を続行します。

子犬を氷の上に2分間置いて麻酔します。子犬が氷の上にいる間に、注射液を注射器に装填します。麻酔をかけたら、子犬をフレームに移し、ガーゼで覆われたイヤーバーの間に頭を固定します。頭蓋骨の背側が水平でフレーム表面と平行であることを確認してください。また、頭蓋縫合糸ははっきりと見える必要があります。

子犬の頭が十分に固定されていないと、注射中に動きますが、フレームのイヤーバーの間にしっかりと押し付けられすぎると、ラムダが見えなくなり、頭内の圧力により注入された溶液が強制的に漏れます。

子犬をフレームにしっかりと掴んだ状態で、70%エタノールで頭を拭き取ります。次に、針を下げて、ラムダに接触するように位置を調整します。次に、針を上げて横に0.8ミリ、吻側に1.5ミリ動かします。次に、皮膚がわずかにくぼむまで再び下げます。この位置の座標を記録します。次に、針を皮膚と頭蓋骨を通って側脳室の皮質に1.5ミリメートル

そこで、0.75マイクロリットルを90秒かけて注入し、溶液が分散するまで1分間待ちます。待っている間、次に注射される子犬に麻酔をかけることができます。待った後、ゆっくりと針を上げます。次に、子犬を加熱ランプの下の回復場所に移します。麻酔から加温までの時間は10分未満でなければなりません。早ければ早いほど良いです。

呼吸を監視し、必要に応じて手足を優しくこすって呼吸を刺激します。子犬が温まり、バラ色で安定した呼吸になったら、母親に戻します。