ニワトリ胚小脳スライスのex vivoエレクトロポレーション:顆粒細胞発生を可視化するための緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNAを導入する方法

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脳顆粒細胞は、脳で最も豊富なタイプのニューロンです。外側の顆粒層であるEGLは、粒状細胞前駆体(GCP)のみで構成されており、分化して内側に移動して内側の顆粒層であるIGLを形成します。

顆粒状細胞の発生を視覚化するには、ペトリ皿のベースにアノードを取り付けてエレクトロポレーションチャンバーを準備します。電極を覆うために培地を追加します。次に、培地で覆われた電極に培養インサートを置きます。ニワトリ胚小脳スライスを矢状方向で培養インサートに移します。

矢状面により、標的層 - EGL をさまざまな小脳層に対して識別できます。GFPプラスミドDNAを含む粘性色素溶液をEGL上に加えます。GFPプラスミドDNAは、細胞質内に均一に分布し、生細胞イメージングを可能にする緑色の蛍光タンパク質をコードします。

次に、EGLの近くの培地にカソードを置きますが、組織に直接配置しないでください。次に、異なるEGL領域に複数の電気パルスを印加します。電気パルスは細胞膜に一時的な細孔を誘導し、細胞がプラスミドDNAを取り込むことを可能にします。その後、プラスミドDNAは顆粒細胞でのGFP発現を可能にします。

小脳スライスを蛍光顕微鏡で画像化し、細胞発生のさまざまな段階にわたる顆粒状細胞の分化と遊走パターンを観察します。

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クトロポレーターの陽極を絶縁テープを使用して60mmのペトリ皿の底面に固定することにより、エレクトロポレーションチャンバーを構築します。電極を覆うために約1ミリリットルのHBSSを追加します。次に、HBSSで覆われた電極の上に0.4マイクロメートルの培養インサートを置きます。

カット

チップ付きの3ミリリットルパスツールピペットを使用して、同定されたスライスをインサートあたり最大5個まで培養インサートに移します。次に、スライスを分離し、矢状方向で培養インサートに落ち着かせます。ピペットを使用して、脳スライスから余分な培地を取り除きます。インサートと電極が接触するように、インサートを電極の上に置きます。

このセットアップでは、スライスを含む培養インサートが培地の表面に置かれ、回路は維持されますが、カソードの空間的ターゲティングが可能になります。P10ピペットチップを使用して、20%ファストグリーンで希釈した5マイクロリットルのDNAを各スライスの標的領域の表面にピペットで移動させます。ファストグリーンを添加することで、DNA溶液の粘性が十分に高く、DNAの広範囲の分散を防ぎます。

次に、カソードを目的の標的組織の上に置き、サンプルをエレクトロポレートします。実際に接触せずにカソードを組織にできるだけ近づけて配置することで、カソードと組織の直接接触を避けてください。必要に応じて、個々の小脳スライスの外部顆粒層の複数の領域でエレクトロポレーションを繰り返します。

終了したら、培養インサートを30ミリメートルのペトリ皿に移します。各培養物に、培養インサートの下に1ミリリットルの予熱培地を追加します。インサートが培地に浮かんでいないことを確認してください。培養インサートは培地と接触する必要がありますが、スライスは培地に浸さないでください。