器官型脳スライス培養におけるシングルセルエレクトロポレーション:脳海馬スライスの標的ニューロン内にプラスミドを送達するためのIn vitro技術

目的のプラスミド溶液を含むガラスピペットを取り出してエレクトロポレーションを開始します。銀線電極が取り付けられたマイクロピペットホルダーに取り付け、電極がマイクロピペットに挿入されていることを確認します。人工脳脊髄液に浸した極薄の海馬切片を含むエレクトロポレーションチャンバーを取ります。

接地電極をチャンバー内に存在する流体に浸し、その後エレクトロポレーションを行います。ピペットチップをエレクトロポレーションチャンバーに下げ、ベースライン抵抗を記録します。顕微鏡を使用して、ピペットチップをターゲットセルの近くに配置します。ピペットが神経膜に接触すると、その抵抗は急激に増加します。

陽圧を加えて、神経膜に小さな陥入を作ります。軽い吸引でメンブレンを押し上げ、ピペットチップとメンブレンの間に緩いシールを作成します。このプロセスをさらに数回繰り返して、膜を調整し、細胞溶解を回避します。

コンディショニング後、強い吸引力を加えて、ギガオームシールと呼ばれる膜でしっかりとしたシールを形成します。電気パルスを使用して、膜の密閉領域に過渡的な細孔を形成します。これらの開口部は、標的ニューロン内のプラスミドの侵入を促進します。エレクトロポレーション後、細孔は再密閉され、プラスミドがニューロン内に閉じ込められます。

エレクトロポレーション用のスライス培養物を調製するには、目的の培養インサートを900マイクロリットルの培地を充填した個々の3センチメートルのペトリ皿に移し、培養物を卓上二酸化炭素インキュベーターに入れます。次に、新鮮な培養インサートをインサートあたり1ミリリットルのスライス培地とともに3.5センチメートルのペトリ皿で少なくとも30分間プレインキュベートし、エレクトロポレーションリグのラインを10%漂白剤で5分間滅菌します。

灌流の最後に、イオン化オートクレーブ水でラインを少なくとも30分間すすぎ、0.001ミリモルのテトロドトキシンを含むフィルター滅菌aCSFで灌流します。エレクトロポレーターのパルスをマイナス5ボルトの振幅、正方形パルス、500ミリ秒の列、50ヘルツの周波数、500マイクロ秒のパルス幅に設定します。ガラスピペットに5マイクロリットルのプラスミド含有内部溶液を入れ、チップを数回軽くフリックして軽くたたいて、閉じ込められた気泡を取り除きます。

解剖顕微鏡を使用してチップが損傷していないことを確認し、ピペットチップを電極にしっかりと取り付けます。チップがaCSFに接触したら、エレクトロポレーターのピペット抵抗の読み出しを記録します。スライス培養物を単離するには、鋭利な刃で培養インサート膜を切断し、鋭角の鉗子を使用してスライス培養物をエレクトロポレーションチャンバーに慎重に移します。次に、スライスアンカーで培養位置を固定します。

目的の細胞のエレクトロポレーションでは、ピペットに口から陽圧を加え、3次元ノブコントロールを使用してピペットチップをスライス培養物の表面近くまで操作します。顕微鏡で培養物を観察し、細胞表面にディンプルが形成されるまで陽圧を加えたまま、先端で標的細胞に近づきます。ディンプルが見えるようにしたら、ピペットチップと原形質膜の間に緩いシールが形成されるように、口から軽度の負圧をすばやく適用します。

メンブレンがピペットにわずかに入ります。スピーカーからのトーンの増加によって示されるように、ピペットの初期抵抗が約2.5倍増加することが観察されるはずです。ディンプルが再形成するように、素早く陽圧を再適用します。次に、一時停止せずに、先ほど示したように、少なくともさらに2つの圧力サイクルをすぐに完了します。最後の圧力パルスの後、負圧を1秒間保持します。スピーカーからのトーンは、ピッチの安定した頂点に達します。フットペダルを使用して、エレクトロポレーターをすばやくパルスします。

エレクトロポレーション後、圧力をかけずにピペットをセルから約100ミクロン静かに引っ込め、正圧を再適用し、抵抗がベースラインの読み出しに類似していることを確認してから、次のセルに近づきます。目的の細胞をすべてエレクトロポレーションしたら、スライス培養物を調製した新鮮な培養インサートの1つに移し、インサートを摂氏35度で最大3日間置きます。