JoVE 実験百科事典
がん研究
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図1:3日齢の新生児マウスから解剖された脊柱と脊髄。(a)の矢印は脊椎の尾側端を指しており、脊髄を解放するために針が挿入されます。解放された脊髄(b)はPBSに沈められていることを示しています。
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図2:遠心分離後に細胞を添加した密度勾配。レイヤーは輪郭が描かれ、漫画の描写でより視覚化されます。最も表面的な層(0)は、通常、脊髄組織からの破片です。レイヤー1はオリゴデンドロサイトとアストロサイトが豊富です。第2層と第3層には、ニューロンの大部分が含まれています。第3層には最も純度の高いニューロンが含まれていますが、第2層には一部の支持細胞(アストロサイトやオリゴデンドロサイト)が見られます。底のペレットには主にミクログリア細胞が含まれています。
脊髄ニューロンを単離するには、新生マウスの脊柱を取り、ペトリ皿の上に置きます。脊柱を生理食塩水バッファーで洗い流して、脊髄を解放します。脊髄を冷たいニューロン培地に移して、細胞の生存を促進します。
次に、脊髄をみじん切りにし、その断片を新鮮なニューロン培地の入ったチューブに移します。順応のためにチューブをシェーカーウォーターバスでインキュベートします。インキュベーション後、使用済み培地を取り出し、消化培地を加えます。消化酵素は組織マトリックスを切断して細胞を緩めます。
組織断片をピペットに吸引して粉砕を実行し、成分を迅速に空にして、個々の細胞を懸濁液に放出します。次に、この懸濁液を密度勾配媒体と遠心分離機を含むチューブに移します。
遠心分離後、チューブの表層には組織の破片が含まれています。最初の層には、オリゴデンドロサイトとアストロサイトが含まれます。2 番目と 3 番目の層はニューロンで構成され、3 番目の層は最も純度が高くなります。最後に、ペレットにはミクログリア細胞が含まれています。
3番目の層を新しいチューブに集め、ニューロン培地を加えて密度勾配培地を希釈します。ニューロンをペレット化するための遠心分離機。上清を廃棄し、ペレットを神経基底培地に再懸濁して、さらなる実験のためにニューロンを保存します。
この手順を開始するには、はさみを使用して安楽死させたマウスの子犬の頭を体から分離します。次に、背側を上に向けて、手順台の上で尻尾と腕を安定させます。次に、湾曲した虹彩はさみを使用して皮膚を切り取ります。その後、腰のすぐ上の腰部から脊髄を切断し、胸部の両側を切断して体から分離します。
5ミリリットルの滅菌PBSを含む3つの10センチメートルのペトリ皿でサンプルを10秒間順番に洗浄し、余分な組織を除去します。続いて、5ミリリットルの滅菌PBSで満たされた22ゲージの針と注射器を脊柱の尾端に挿入し、頭蓋側にフラッシュし、臍帯が4番目のペトリ皿に出るようにします。
氷上で 5 ミリリットルの HABG を入れた 15 ミリリットルのチューブで脊髄を移します。脊髄を押しつぶさないようにし、残りの子犬にも同じ手順を繰り返します。理想的には、このプロセスは、健康なニューロンの分離を確保するために、1つのグループの子犬に対して30分以内に完了する必要があります。
密度勾配を準備するには、4つの15ミリリットルチューブに4つの層のそれぞれを準備します。次に、各層を 1 ミリリットルの新しい 15 ミリリットルのチューブに加えます。一番下のレイヤー1から始めて、一番上のレイヤー4に達するまで順番に追加します。追加中に層を乱したり、混合を引き起こす可能性のある激しい動きを避けてください。次に、消化培地をみじん切りにした組織に加えます。サンプルを摂氏30度のウォーターバス内のシェーカーに入れます。その後、ティッシュをウォーターバスから取り出し、数分間沈殿させます。
粉砕を行うには、余分な消化媒体を吸引します。組織を2ミリリットルのHABGに懸濁します。ナローボアピペットを使用して、45秒で10回粉砕し、空気の導入は生存可能な収量を大幅に低下させるため避けてください。粉砕は、手順の最も重要なステップの1つです。組織は、神経細胞の死につながる可能性のある過剰な活力を避けたり、収量が低下したりする可能性のある過度の活力を避けて、火で研磨されたピペットから慎重に引き込んだり空にしたりする必要があります。
その後、上清の上部2ミリリットルを吸引し、「コレクション」とラベル付けされた新しい15ミリリットルのチューブに移します。収集手順をさらに2回繰り返して、6ミリリットルの上清を生成します。次に、グラジエントの中断を避けて、収集チューブの内容物を事前に準備したグラジエントチューブにゆっくりと移します。
ニューロンを精製するには、グラジエントチューブを800 x g、摂氏22度で15分間遠心分離します。目的の層を集め、新しい 15 ミリリットルのチューブに移します。最高純度のニューロンを単離するには、レイヤー3を収集します。より低い純度でより多くの収量を得るには、レイヤー2〜3を収集します。
次に、新しく収集した層に5ミリリットルのHABGを加えて密度勾配を希釈します。200 x g で摂氏 22 度で 2 分間遠心分離します。2分後、上清を廃棄し、ペレットをフリックして細胞を5ミリリットルのHABGに再懸濁します。続いて、サンプルを200 x g で再び摂氏22度で2分間遠心分離します。次に、上清を廃棄し、ペレットをフリックして細胞を3ミリリットルの神経基底培地に再懸濁します。