単離マウス胚へのマイクロバブルの注入:生きたマウス胚の血管系にマイクロバブル造影剤を送達する技術

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マイクロバブル送達の場合は、チューブに接続されたシリンジ内のガス状コアを含む内皮細胞標的脂質殻マイクロバブルの均一な懸濁液から始めます。

このアセンブリをシリンジポンプにロードし、ガラス針をチューブに取り付けます。次に、特定の内皮細胞受容体を発現する冷やしたマウス胚をステレオスコープのステージ上に配置された皿に移します。

卵黄嚢と羊膜から胚をそっと外側に出します。嚢と胎盤の端を固定します。胚を温かい緩衝液ですすぎ、血流を回復させます。最適な超音波伝達のために、予熱した超音波ゲルで胚を覆います。生理学的状態を維持するために緩衝液を補給します。

シリンジポンプを使用して、胎盤椎間板の胎児膜表面の適切な静脈に所望の流量でマイクロバブル懸濁液を慎重に注入します。注入されたマイクロバブルは循環を通過し、血管の内側を覆う内皮細胞の特定の受容体に結合します。

超音波トランスデューサーを使用して、高周波超音波を胚に送信します。マイクロバブルの圧縮性の高いガスコアにより、マイクロバブルは非線形に振動し、入射波とは異なる周波数の超音波を散乱させます。これらの信号と組織の線形信号はトランスデューサーに戻ります。

トランスデューサーはそれらをイメージング システムに中継し、マイクロバブル散乱信号と組織信号を区別し、胚血管の造影超音波画像を生成します。

必要な量のマイクロバブル原液をピペットでピペットで移動し、生理食塩水のアリコートに加えます。ピペットの先端で軽くかき混ぜながら混ぜます。次に、21 ゲージの針を使用して、希釈したマイクロバブル溶液を清潔な注射器に引き込みます。針を抜いた後、シリンジから気泡を取り除き、ルアーとチューブを取り付けます。気泡が発生しないように、溶液をチューブの端までゆっくりと押し込みます。

最後に、シリンジをシリンジ注入ポンプに挿入し、毎分 20 マイクロリットルの速度でマイクロバブルを分注し、総量は 20 マイクロリットルになります。引っ張ったガラス針をチューブの端に取り付けます。ポンプを注入ステージに近づけます。穴あきスプーンを使用して、冷やした培地皿から1つの胚をランダムに選択して取り出します。ステレオスコープの下の超音波ステージにある解剖皿に胚を置きます。

次に、血管新生が最も少ないと思われる胚の側を見つけます。これは、一般的に頭部に隣接する、血管新生が低い領域です。次に、細い鉗子を使用して、卵黄嚢と羊膜を内側から取り除くことができる程度に切ったり引き裂いたりしますが、それ以上は取り除くことはできません。次に、胚の周りから嚢をそっと動かします。次に、胎盤と臍帯血管を前にして胚を横向きに置きます。

粘土の小片を使用して解剖皿を安定させます。4本の昆虫ピンを使用して、卵黄嚢と胎盤の端をピンで固定し、主要な血管を避けます。摂氏45度に予熱したPBSを含む注射器を使用して、血液が胚に流れ込むのが見えるまで胚を洗浄します。臍帯動脈は、拍動性の真っ赤な血液によって識別されます。臍帯静脈とそれに関連する血管網は血液が濃く、通常は胎盤側の臍帯動脈からの血液を覆います。

この時点で、注射が快適に行えるように皿を配置します。胚が復活したら、胎盤を覆いますが、胎盤は覆わずに、予熱した超音波ゲルで覆います。細い鉗子を使用して胚の周囲から気泡を繊細に取り除き、予熱したPBSを皿に補充します。手順全体を通して、PBSおよびゲルシリンジ内の溶液レベルに注意し、必要に応じて予備のシリンジを加熱ビーカーに追加してください。

次に、解剖皿の端にある大きな粘土のボールにガラス針を取り付け、針の端をPBSに挿入します。胎盤椎間板の絨毛膜表面にある静脈を、主枝からできるだけ遠く離れた静脈を選択してください。次に、はさみを使って血管のサイズに合わせて針先を切り取り、先端をわずかな角度で切ります。バネはさみの端を使って、ガラスのギザギザの端を取り除きます。

次に、シリンジポンプを使用して、すべての空気が針先から排出され、マイクロバブルがPBSに自由に流れ込むのが見られるまで、毎分20マイクロリットルのマイクロバブル溶液をガラス針にゆっくりと注入します。ポンプを停止し、注入量を20マイクロリットルにリセットします。胚の血管系に空気が注入されないように、注射針に空気が入らないようにしてください。

ガラス針の先端を胎盤の選択した静脈にそっと挿入し、動かないことを確認します。ステレオスコープヘッドを振り払い、胚が6〜10ミリメートルの病巣の間に均等に配置されるように超音波トランスデューサーを配置します。次に、イメージングを開始し、マイクロバブルのボーラス注入を開始します。1分後、注入が完了したら、データ収集ステップのタイマーを開始します。

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Last updated: 18 July 2026