スワブを用いた結膜共生細菌の単離:マウスモデルの結膜から共生細菌を単離する技術

目の結膜には共生細菌がいます。この固有の微生物叢は、免疫細胞を活性化して目の裏地に侵入する有害な微生物を攻撃することで、目を感染から保護します。

共生細菌を単離するには、麻酔をかけたマウスを側臥位に置きます。適切な培地に浸した滅菌眼綿棒を取ります。濡れた綿棒の先端を左目の内側結膜領域に挿入します。眼球を押し下げ、綿棒を結膜に沿って前後に動かして、多様な共生集団を収集します。

綿棒を取り出し、微生物濃縮培地の入ったチューブに入れて撹拌します。このステップにより、閉じ込められた細菌が綿棒の綿メッシュから培地に放出されます。綿棒を廃棄し、細菌の増殖の開始を促進するためにチューブをインキュベートします。

眼ぬぐい液を接種した濃縮培地を数滴、血液寒天プレートに所望のパターンで分注し、インキュベートします。培地中に存在するカゼインと大豆ペプトンは、ペプチド合成に必要な窒素を供給し、塩化ナトリウムは浸透圧平衡を維持します。

共生細菌は、血液培地中に存在するヘモグロビンを消化する溶血酵素を持っています。これにより寒天プレート上に特徴的なパターンが生成され、さまざまな細菌が形態学的に異なるコロニーに増殖します。コロニーの数を数えて、結膜内の相対的な存在量を決定します。

後ろ足パッドを握って、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。動きがない場合にのみ進めてください。片方の手を麻酔マウスの扱いに、もう一方の手で眼の綿棒と培養物を扱います。マウスをケージから取り外し、左目を露出させて横向きに置いた作業面の上に置きます。手袋をはめた手にイソプロパノールをスプレーし、ペーパータオルで乾かします。

ラベルの付いたBHIマイクロ遠心分離管のキャップを専用の培地ハンドリングハンドで外し、チューブをラックに戻します。綿でコーティングされたアイスワブの先端をBHIに浸します。次に、先端をインナーチューブに2回回しながらチューブから綿棒を引き出し、余分な液体を取り除いて取り除きます。

マウスを扱う手で、首筋をそっと持ちます。もう一方の手で、目の綿棒の先端を左目の内側結膜領域に置きます。眼球を軽く押し下げ、綿棒を下まぶたと目の間を窓拭き動作で10回動かし、一定の圧力を保ちます。毛皮に触れずに、綿棒の先端を挿入した場所に垂直にそっと取り除きます。綿棒の綿を下にして、BHI培地を入れたラベル付きの微量遠心チューブに直接入れます。

綿棒で拭いた目に点眼薬を塗布します。必要に応じて、対照サンプル用の皮膚または毛皮の綿棒を入手し、各綿棒の間に手袋を適切に滅菌します。終了したら、マウスをケージに戻します。綿棒を氷の上で10〜15分間放置します。次に、手袋をはめた手を滅菌し、先端を培地に10回転混合しながら綿棒を取り出します。先端をチューブの内壁に5回転させて綿棒を引き出し、バイオハザード容器に廃棄します。マウスごとにこのプロセスを繰り返します。

チューブを摂氏37度で1時間静的にインキュベートすることにより、サンプルを濃縮します。インキュベーション中、マウスの眼の綿棒または対照の綿棒ごとに1つの室温TSAプレートにラベルを付け、半分に分けます。濃縮したサンプルをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。サンプルを短時間渦状にして混合します。次に、10マイクロリットルのサンプルをTSAプレートに分注し、プレートを傾けてストリップを形成します。これを2回繰り返します。

プレートの分割線の反対側に、それぞれ10マイクロリットルのサンプルで10個のドットを作成します。寒天プレートの乾燥を防ぐクリーンチャンバー内で、プレートを摂氏37度で18時間、2日、および4日間インキュベートします。ストリップ内のコロニーを数えます。形態に注意し、形態学的に類似した分離株の綿棒あたりのコロニー形成単位を計算します。