マウス弁間質細胞の単離:マウス大動脈弁からVICを単離および培養するための酵素的方法

心臓の大動脈弁は、密な細胞外マトリックス全体に分布する内弁間質細胞またはVICと、その上にある弁内皮細胞またはVECで構成される三葉構造です。

VICを単離するには、まず、安楽死させたマウスを仰臥位で準備します。正中線の腹部と胸部の切開を通して、心臓を露出させます。左心房と心室の間に小さな切り傷をつけ、その後生理食塩水灌流して血液を排出します。大動脈弓レベルで上行大動脈を切断し、心臓を採取します。

心室の遠位部の3分の2を横断して廃棄してから、心臓の残りの部分を縦方向に解剖して「U字型」の大動脈弁尖を明らかにします。リーフレットを切除し、冷やした緩衝液ですすぎ、血液を取り除きます。

いて、リーフレットを低濃度コラゲナーゼ溶液で処理し、インキュベートします。低濃度では、タンパク質分解酵素であるコラゲナーゼは細胞外マトリックスを部分的にしか分解せず、リーフレットから表面VECを取り除きます。

遠心分離して酵素含有上清を緩衝液と交換し、再懸濁したペレットをペトリ皿に移します。リーフレットを集め、2回目の消化のために高濃度コラゲナーゼ溶液で処理します。インキュベーションすると、コラゲナーゼは細胞外マトリックスをさらに分解し、VICを溶液中に放出します。

遠心分離してVICをペレット化し、適切な媒体に再懸濁します。最後に、少量の細胞懸濁液をマルチウェルプレートに播種して、VICをウェル底に付着させます。VICが増殖できるようにインキュベートします。

実験を開始する前に、すべての手術器具と作業スペースを70%エタノールで洗浄および滅菌し、手術器具を30分間オートクレーブします。初期セットアップの準備ができたら、エタノールを使用して生後8週間の安楽死マウスの胸部と腹部領域を洗浄することから始めます。

さみを使って、マウスの腹部と胸を開きます。次に、小さな外科用ハサミで左心房と左心室の間を切ります。10ミリリットルの冷たいPBSを灌流して心臓から血液を取り除き、上行大動脈の3ミリメートルを保ちながら心臓を切断します。実体顕微鏡下で、心室の中央で心臓を水平に切断し、左心室を大動脈に向かって切断することにより、大動脈弁を解剖します。次に、大動脈弁を注意深く解剖します。バルブを小さな35mmの組織培養皿にプールします。

生物質を添加した5ミリリットルの新しく調製された10ミリモルのコールドHEPESで75ミリリットルの細胞培養皿で単離されたバルブを洗浄し、5ミリリットルのコラゲナーゼI型で摂氏37度で30分間インキュベートし、継続的に振とうします。インキュベーション後、チューブを150 x g で5分間遠心分離し、ペレットを2ミリリットルのミリモルHEPESで30秒間高速ボルテックスして1回洗浄します。

得られた懸濁液をチューブから35mmの培養皿に集め、細いピンセットを使用して組織断片を新しいチューブに慎重に移します。次に、ペレットを15ミリリットルのチューブ内で5ミリリットルのコラゲナーゼI型を摂氏37度で35分間連続攪拌下でインキュベートします。1ミリリットルのピペットで再懸濁し、摂氏4度で5分間150 x g で遠心分離して細胞を分離します。分離したペレットを2ミリリットルの完全DMEMに再懸濁し、摂氏4度で5分間150 x g で遠心分離することにより、細胞を2回洗浄します。

プレーティングの場合は、ペレットを1ミリリットルの完全培地に再懸濁し、最小量の培地で6ウェル細胞培養皿の1ウェルに加えます。プレートは摂氏37度、二酸化炭素5%で邪魔されないようにしてください。3日間のインキュベーション後、顕微鏡下で細胞を観察して、組織破片に近い成長を確認します。1,000個の細胞が見えたら、オートクレーブピンセットで組織の破片を慎重に取り除き、培地を交換します。