マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

この手順の全体的な目的は、マウス胚の中枢神経系の目的の発達段階および脳領域において、効率的な遺伝子導入を行うことです。まず、子宮への損傷を防ぐために、精密毛細管と針型電極を準備します。次に、標的へのDNA注入に向けて、光ファイバーケーブルを用いて小さな胚を可視化し、胚を保持する独自の手法を習得します。

本手順の第3ステップでは、脳の浅い部分にDNAを導入するため、子宮表面にスティック型電極を用いてエレクトロポレーションを行います。そして、本手順の最終ステップとして、視床や視床下部などの脳の深部構造に針状電極を用いてエレクトロポレーションを行います。最終的に、皮質層特異的な導入、または視床への効率的な導入を示す結果を得ることができます。従来の通常のin utero electroporationなどの手法に対する本技法の主な利点は、子宮内胚の導入部位における視認性と制御性が向上している点にあります。

光ファイバーのようなケーブルを用いることで、E 9.5からの胚の可視化と、視床や視床下部などの脳深部へのプラスミドDNA導入のための針の穿刺が可能になります。この手法は、神経分化、脳のパターニング、神経接続など、発達中の脳に関する重要な疑問を解明するのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな人は、針や電極の成形、およびそれらの位置合わせに苦労します。

子宮および胚。この手法を視覚的に実演することは、精密な針電極の作製方法および電極間での胚の配置方法を確認するために不可欠です。これら2つのステップが、結果を成功させるための鍵となるためです。キャピラリーを準備するには、製造元の指示に従ってマイクロピペットプラーを使用してください。

本手順では、内部ファイバーのない直径1mmのガラスキャピラリーチューブを使用します。引き出した針は、解剖顕微鏡を用いて先端から800µmから1mmの長さ、外径60µm未満であることを確認し、ピンセットで針の先端を直径20〜30µmまで切り詰めます。各針の寸法をマイクロメーターで測定してください。

次に、コイル状に巻いてマイクロ電極を作製します。タングステン線を金メッキピンに巻き付けます。陰極にはタングステン線を、陽極には白金線を使用してください。

ワイヤーをパラフィルムでピンに固定します。次に、ワイヤーを綿棒のプラスチック製の軸に挿入し、両端をパラフィルムで均一に巻いて固定します。その後、細目のサンドペーパーでワイヤーの先端を研磨し、先端部の直径を 20 to 30 µmに、先端から 800 µmから 1 mmの範囲の直径を 60 µmにするまで整えます。最後に、マイクロメーターを用いて最終的な寸法を確認してください。

次に、研磨したワイヤーをマニキュアの滴に浸し、絶縁のためにワイヤー全体に薄く塗布します。マニキュアが乾燥した後、アセトンを染み込ませた綿棒を使用して、先端から200 µmまでの部分のマニキュアを除去します。白金電極は既製品を購入するため、準備は不要です。

本手順では、CUY six 10 P four dash one nepo gene電極を使用します。maxi-prepまたは同等の方法で血漿DNAを精製し、100 µgのDNAを新しいチューブに分注し、1% Fast Green染料を10 µL加えます。TEを用いて全量を100 µLまで調整し、最終的な血漿DNA濃度を1 µg/µLにします。ピペッティングにより溶液を穏やかに混合した後、室温で14,000 RPMで5分間遠心分離し、不純物と塩を除去します。

SNATを新しいチューブに移します。DNA溶液は、全工程を通じてチューブに入れたまま室温で保存可能です。次に、メーカーの指示に従ってマイクロマニピュレーターに引いた針（pulled needle）を装着し、針の先端をDNA溶液に浸して溶液を充填させます。

マイクロマニピュレーターを慎重に脇に置き、手術の準備を行います。胎生9.5日から15.5日の妊娠マウスの体重を測定し、体重を決定します。

次に、薬用グレードのペントバルビタールナトリウムを体重1gあたり50µgの用量で腹腔内投与し、5分間待機します。ペントバルビタールナトリウムの代替として、ケタミン、キシラジン、注入麻酔、またはガス麻酔を使用することも可能です。

麻酔後、カミソリと50% ethanolを用いて腹部の除毛を行います。Betadineと70% alcoholで交互にスクラブし、皮膚を処置します。細い鋏を用いて、腹部正中線に切開を加えます。

すべての子宮角を注意深く引き出し、創傷周囲に配置した1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で湿らせた綿ガーゼの上に置きます。子宮は常にPBSで湿った状態に保ってください。フレキシブル光ファイバーケーブルを使用します。

ケーブルを子宮角の下に配置します。光学ファイバーライトと親指の間に子宮を挟み、ゆっくりと圧迫して胚を子宮壁に近づけます。胚の頭部が左側にあり、上を向いた状態で、ガラスキャピラリーを標的の脳室に慎重に挿入し、胚齢13.5日の皮質第4層へのエレクトロポレーションのため、約1 µLのDNA溶液を注入します。

スティック状の白金電極を子宮の外側に配置し、38 V、50 msの矩形波電流パルスを5回印加します。胚齢10.5日で視床または視床下部を標的としてマイクロエレクトロポレーションを行う場合は、微細なタングステン陰極をDNA注入済みの脳室に、白金陽極を子宮内に挿入します。標的領域を両電極端の間に位置させ、推奨される矩形波電流パルス（7 V、100 ms）を3回印加します。

エレクトロポレーション完了後、子宮角を元の位置に戻し、500 µLのPBSを加えます。切開部の内層を外科用縫合糸で縫合します。その後、9 mmのオートクリップで外層を閉じます。

マウスをヒーターパッドの上に2時間置き、手術と麻酔から回復させます。ここでは、胚齢13.5日、14.5日、および15.5日における皮質領域へのプラチナ電極による電穿孔法が示されています。脳は出生後に採取しました。

6日目。エレクトロポレーションされた皮質細胞の層は、各実験で明らかに異なっています。これは、時間依存的なエレクトロポレーションにより、皮質層特異的な機能獲得および機能喪失が可能であることを示唆しています。

ここに示すように、視床や視床下部などの深部組織へのエレクトロポレーションを行います。スティック状の白金電極を使用すると効率が低くなることが多いため、マイクロ電極を用いてエレクトロポレーションを実施します。これらの深部組織において、より高い効率と生存率が得られます。

マウス胚の第三脳室にプラスミドDNA溶液を注入しました。胚齢11.5日に、視床に限定したニードルエレクトロポレーションを実施しました。視床の大部分のエキソンは、生後6日までに皮質へと投射します。ここでは、発達中の頭部にP-C-A-G-E-Y-F-Pをマイクロエレクトロポレーションする手法を示します。

視床の領域は、すべての視床後有糸分裂ニューロンを標識するRORCによって示されています。皮質第4層へ向かう白矢印で示された軸索投射は、ニューロン全体を満たすEYFPによっても可視化できます。皮質における第4層の位置も、RORC抗体によって標識されています。

MAを開始すれば、適切に実施することで、この手法は1リットルあたり15分で完了させることができます。この手順を行う際は、その後の工程で損傷が生じないよう、テストサンプルを非常に慎重に扱うことが重要です。また、細胞分化後の分子メカニズムを理解するために、特定のクロモソームをMDNAに組み込むなどの他の方法を実施することも可能です。

本手法は、中枢神経系の発達分野の研究者が、パターン形成、軸索伸展、および回路形成における分子メカニズムを探索するためのものである。