IPEおよびRPE細胞の単離:ウサギの眼から眼の色素上皮細胞を得るための技術

色素上皮細胞は、タイトジャンクションによって接続された終末分化した立方体細胞です。虹彩の内側を覆うこれらの上皮細胞は虹彩色素上皮またはIPE細胞であり、網膜の近くにある細胞は網膜色素上皮またはRPE細胞です。

これらの細胞を抽出するには、無傷のウサギの目を取ります。目の表面から微生物を取り除くために、消毒剤で目を治療します。消毒剤を緩衝液で洗い流します。虹彩の近くを切開します。この開口部を使用して、虹彩の境界に沿って完全な円形の切り込みを行い、虹彩を含む前部と網膜と硝子体液を含む後部に眼を分割します。

前眼部を取り、虹彩にアクセスするためにレンズを捨てます。虹彩を取り除き、培養皿の上に置きます。続いて、後部を採取し、ゼラチン状の硝子体液と網膜を眼球から捨てます。

虹彩と眼球をトリプシンで処理し、インキュベートします。トリプシンはタイトジャンクションと細胞外マトリックスタンパク質を分解し、上皮細胞の解離を開始します。トリプシンを廃棄し、適切な培地を追加します。虹彩と眼球の表面をそっとこすり落とし、培地中の上皮細胞を放出します。

最後に、IPE細胞とRPE細胞を別々のウェルに播種します。細胞は、さらなる下流アッセイの準備ができています。

動物を安楽死させた後、湾曲したハサミとコリブリ鉗子を使用して目を摘出し、目から残りの筋肉組織と皮膚をきれいにします。非滅菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに目を集め、チューブを層流フードに移します。ヨウ素ベースの溶液に2分間浸して消毒し、滅菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに目を移します。

片目を滅菌ガーゼ湿布に当て、視神経に近づけてから、#11メスで虹彩の限界付近を切る。はさみを使用して、虹彩の周りを切り取り、前眼部を取り除き、網膜色素上皮細胞(RPE)細胞が分離されるまで、球根に硝子体を残したペトリ皿に入れます。

虹彩色素上皮細胞、またはIPE細胞を分離するには、細い鉗子でレンズを取り外し、IPE細胞を含む虹彩を繊細に引き抜きます。虹彩をペトリ皿に入れ、滅菌PBSで洗浄します。500マイクロリットルの0.25%トリプシンを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンを取り除き、500マイクロリットルの完全培地を加え、平らな火で磨いたパスツールピペットでIPEを繊細にこすります。

細胞懸濁液を集め、1.5ミリリットルのチューブに入れます。ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントし、1ミリリットルの完全培地を含む24ウェルプレートにウェルあたり20万個の細胞を播種します。プレートをインキュベーターに入れ、摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。

RPE細胞を分離するには、細い鉗子で後部から硝子体液と網膜を取り除きます。球根を24ウェルプレートに入れ、1眼あたり500マイクロリットルの0.25%トリプシンを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンを除去し、地球あたり500マイクロリットルの完全培地を加え、湾曲した火で研磨されたパスツールピペットでRPE細胞を繊細にこすります。

細胞懸濁液を集め、1.5ミリリットルのチューブに入れます。ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントし、前述のように細胞を播種します。プレートをインキュベーターに入れます。