JoVE 実験百科事典
生物学
0 回視聴 • 4:35 分 • July 8th, 2025
細気管支は肺の管状気道です。慢性感染症の間、粘液の蓄積により細気管支が詰まります。栄養豊富な粘液は、日和見細菌が増殖するのに適した環境を提供します。これらの細菌は、自己生成された細胞外ポリマーマトリックスに埋め込まれ、増殖してバイオフィルムを形成します。
肺の細菌バイオフィルムの発達を模倣するには、ペトリ皿でブタ細気管支組織標本を採取します。組織を所望の形状の断片に解剖します。ペトリ皿にバイオフィルム培地を追加します。UV光の下で皿を滅菌し、表面の汚染物質を除去します。
滅菌した組織片を、細菌接着に最適な基質として機能するバイオフィルム培地とアガロースパッドを含むマルチウェルプレートに移します。次に、目的の細菌のコロニーを含む針先を各組織片に刺して、プランクトン菌を組織に導入します。プレート表面全体の均一な酸素交換を容易にするUV滅菌された多孔質膜でプレートを密閉します。密封されたプレートをインキュベートします。
インキュベーション中、細菌は線毛を介して上皮表面に不可逆的に付着し、細胞外マトリックスを分泌し始めます。マトリックス内では、細菌はエネルギー源、ムチン、培地からの遊離 DNA を利用してバイオフィルムを形成します。細菌バイオフィルムモデルは、さらなるテストの準備ができています。
細気管支を最初のDMEM / RPMI 1640洗浄に入れます。それを洗浄したままにして、同じ肺から細気管支の追加の切片を採取して、計画された実験に十分な組織切片を生成します。同じ肺から追加の細気管支切片を洗浄液に入れ、少なくとも2分間洗浄液に放置します。
最初の洗浄から細気管支を取り除き、サンプルを滅菌ペトリ皿に入れます。組織を損傷しないように注意しながら、滅菌鉗子で各細気管支を軽く保持します。残っている軟部組織をできるだけ取り除き、滅菌解剖ハサミを使用して組織を幅5mmのストリップに切断します。
すべての細気管支組織ストリップを2回目のDMEM / RPMI 1640洗浄に入れます。少なくとも2分間洗ったままにします。次に、滅菌鉗子を使用して2回目の洗浄からティッシュストリップを取り除き、清潔で滅菌されたペトリ皿に入れます。細気管支に付着した残りの軟部組織を取り除き、滅菌解剖ハサミを使用してストリップを正方形に切ります。
3回目のDMEM / RPMI 1640洗浄液をペトリ皿に加え、皿を旋回させて洗浄液中のティッシュ片を軽く混合します。ティッシュ片を取り除かずに、ペトリ皿から3回目の洗浄
液を注ぎます。次に、最後の SCFM 洗浄を追加し、すべての組織片が覆われていることを確認します。SCFMで組織をUV光下で5分間滅菌します。滅菌鉗子を使用して、滅菌された各細気管支組織片をSCFMアガロースパッドを含む24ウェルプレートの個々のウェルに移します。
各組織片を目的の細菌株で感染させるには、滅菌された0.5ミリリットルのインスリン注射器に取り付けられた29ゲージの針の先で寒天プレート上で成長したコロニーに触れます。次に、コロニーをティッシュ片に接触させ、表面をそっと刺します。感染していないコントロールの場合は、針の先端で組織片の表面をそっと刺します。
次に、ピペットを使用して各ウェルに 500 マイクロリットルの SCFM を追加します。各24ウェルプレートの通気性のあるシーリングメンブレンを紫外線下で10分間滅菌します。24ウェルプレートから蓋を取り外し、通気性のあるメンブレンと交換します。次に、プレートを振らずに摂氏37度でインキュベートします。