ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)単離:収穫されたブタ腹部大動脈から内皮細胞を単離するための酵素ベースの方法

大

動脈 - 心臓から体に酸素化された血液を運ぶ大動脈 - は、内内膜、中中層、外外膜の 3 つの層または「チュニック」で構成されています。内皮細胞またはECは、構造タンパク質、主にコラーゲンからなる支持基底膜上の薄くて連続した単層として内膜に存在します。

ECを単離するには、培養皿で採取したブタ大動脈から始めます。その末端と周囲の接着組織を切除して、非内皮細胞汚染を防ぎます。微生物の増殖を阻害するために、抗生物質を含む緩衝液で大動脈を洗浄します。

滅菌外科用縫合糸を大動脈に通し、その端の一方を結び、縫合糸を内腔内に保ちます。結ばれた端を固定し、縫合糸を引っ込めて大動脈を完全に反転させます。これにより、ECを含む内膜が酵素消化にさらされます。最適な酵素活性を得るために、予熱した低濃度コラゲナーゼ溶液で大動脈を処理し、インキュベートします。

コラゲナーゼは、EC の下にある基底膜に存在するコラーゲンタンパク質を分解し、それらの解離を開始します。インキュベーション後、冷やしたバッファーを加えてコラゲナーゼ酵素を不活性化します。

大動脈内膜表面をそっとこすり、バッファーですすぎ、ECを溶液に放出します。この溶液を遠心分離してECをペレット化します。ペレットを適切な培地に再懸濁します。細胞懸濁液を培養フラスコに播種し、インキュベートします。ECはフラスコの底に付着して増殖します。

ブタ大動脈内皮細胞の単離では、ブタ大動脈を無菌条件下で150ミリメートルのペトリ皿に移し、血管の両端をそっと取り除きます。滅菌鉗子とハサミで血管がクランプされた追加の余分な組織を切り取り、20〜50ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーを使用して大動脈の外側と内側をすすぎます。

次に、外科用縫合糸を大動脈に通し、血管の一端を緩く結び、縫合糸を内腔内に保ちます。鉗子で結ばれた端の近くの大動脈をそっと固定し、大動脈の内皮表面が露出するまで外科用縫合糸をゆっくりと引っ張って大動脈を反転させます。

洗浄

ごとに10ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーで大動脈の内皮表面を3回洗浄し、大動脈を15ミリリットルの遠心分離管に入れます。サンプルを摂氏37度で温めた0.005%コラゲナーゼIV消化液10ミリリットルで覆い、組織を摂氏37度で15分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、チューブ内容物全体を100ミリメートルの培養皿に移し、10〜15ミリリットルの予冷停止バッファーで消化を停止します。細胞スクレーパーを使用して、血管の内面から大動脈内皮細胞をそっと取り除き、洗浄ごとに5ミリリットルの洗浄バッファーで容器を3回洗浄します。

最後の洗浄後、上清を50ミリリットルの遠心分離管に移し、洗浄ごとに5ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーで培養皿の底を2回洗浄し、洗浄液を50ミリメートルのチューブにプールします。

遠心分離によって細胞を回収し、最後の10ミリリットルの上清を除くすべてを廃棄します。20ミリリットルの洗浄バッファーを加えてペレットを再懸濁し、気泡を避けるように注意し、別の遠心分離で細胞を回収します。

ペレットを1ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁して計数し、25センチメートル平方フラスコ濃度あたり1 x 10〜6細胞で細胞をプレーティングします。次に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞培養インキュベーターに入れ、2〜3日ごとに培地をリフレッシュします。