極低温ストローを用いたウサギ胚ガラス化:ウサギ胚を長期保存するための超急速冷却技術

胚ガラス化は、胚を超高速で超低温に冷却し、長期保存を容易にする超高速凍結保存技術です。

まず、採取したウサギの胚を適切な培地で採取します。低濃度の細胞透過性凍結保護剤(エチレングリコール(EG)、ジメチルスルホキシド(DMSO))を含む平衡溶液で胚をインキュベートします。EGとDMSOは細胞膜を通り抜けて拡散し、細胞内の水分子を置き換え、細胞内の氷結晶形成を防ぎます。

次に、高濃度のEGおよびDMSOを含むガラス化溶液で胚をインキュベートして、凍結保護剤の適切な浸透と十分な細胞内水流出を可能にし、細胞を凍結損傷から保護します。

滅菌極低温ストローキャリアをマイクロディスペンサーに結合します。マイクロディスペンサーを使用して、ストローに目的の培地を適切なレベルまで満たします。次に、気泡を吸引し、続いて最小限の量の胚を含むガラス化溶液と別の気泡を吸引します。

最初の培地画分が粉体塗装された綿プラグを濡らして重合し、ストローの端を密閉するまで、培地を再度吸引します。もう一方の端を疎水性ストロープラグで閉じます。空気セグメントと培地セグメントは、密閉されたキャリア内で胚を分離するのに役立ちます。

ストローを-196°Cの液体窒素に短時間浸します。担体は高い冷却速度を保証し、胚をガラスのようなアモルファス相に固化させ、少量のガラス化溶液と凍結保護剤の使用により浸透圧ストレスが軽減されます。代謝活性が停止したガラス化胚は、使用するまで保存できます。

胚のガラス化では、胚を平衡化溶液に2分間浸漬し、その後ガラス化溶液で1分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、胚を125マイクロリットルのプラスチック製ミニストローに入れ、ストローの閉じた端を適切な1ミリリットルのマイクロディスペンサーに接続します。ストローの長さの3分の1までベース培地を吸引し、続いて小さな気泡を吸い込みます。

次に、実体顕微鏡を使用して40マイクロリットルのガラス化溶液で胚を吸引し、続いて最初の液体画分をミニストローの綿の端まで移動させるのに十分なベース培地に別の小さな気泡を吸引します。次に、ミニストローの開いた端をストロープラグで閉じ、ミニストローを液体窒素に直接突っ込んでガラス化を達成し、ミニストローを液体窒素デュワーに保管します。