Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing:二本鎖ホモロジー依存性修復機構によるヒト多能性幹細胞のゲノム改変技術

ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはZFNには、リンカーを介してエンドヌクレアーゼドメインに接続された亜鉛イオン安定化DNA結合マクロドメインが含まれています。この構造は、DNAを切断しながら特異性を維持するのに役立ちます。

ゲノム編集にZFNを使用するには、ヒト多能性幹細胞の培養を行います。ZFNをコードするプラスミドで補完します。標的遺伝子と抗生物質耐性遺伝子を含む修復プラスミドを相同性アームまたはHAの間に挟み込みます。電流が細胞内のプラスミドの侵入を促進する細胞とDNAの混合物をエレクトロポレートします。

中に入ると、翻訳されたZFNのジンクフィンガーモチーフは、宿主ゲノム内の相補的な塩基対のトリプレットに結合し、Fok-1制限エンドヌクレアーゼを標的部位に正しく配置します。ZFNは対で反対側の鎖に結合し、Fok-1ホモ二量体化が活性触媒中心を形成し、そこでFok-1がDNA二本鎖切断またはDSBを生成し、4ヌクレオチドオーバーハングを生成します。

修復プラスミド中のHAの存在は、張り出した端が反転し、相同HA配列をテンプレートとして使用する相同性依存性修復を導きます。DNA合成は、標的遺伝子に相補的なヌクレオチドを追加することによって継続されます。

結果として生じるギャップはライゲーションされ、遺伝子挿入が容易になります。さらに、プロモーターレス抗生物質耐性遺伝子は、挿入部位の上流の宿主プロモーターから発現します。編集に成功した細胞は、抗生物質選択培地で増殖します。

まず

、ゼラチン上で増殖したマイトマイシンC不活化マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞を含む6ウェルプレート上のhESC培地でヒト多能性幹細胞を培養します。プレーティング後、hPS細胞が50%コンフルエントに達するまで、ガラスピペットと真空を使用して培地の全量を除去します。ウェルあたり3ミリリットルの温かいhESC培地と交換します。

ターゲティングの1日前に、hESC培地を取り除き、10マイクロモルのY27632を添加した新鮮な予熱したhESC培地を追加します。また、DR4マウスから薬剤耐性MEFフィーダー細胞の1〜2個の6ウェルプレートを調製します。ターゲティング当日に、5マイクログラムのジンクフィンガーヌクレアーゼ発現プラスミド1および2を1.5ミリリットルのチューブにピペッティングしてトランスフェクション溶液を調製します。

30マイクログラムの修復ドナープラスミドを加え、続いて容量を300マイクロリットルにするのに十分な1Xリン酸緩衝生理食塩水を加えます。細胞を顕微鏡で検査し、50%のコンフルエンシーを確認します。次に、ガラスピペットと真空を使用して、hPS細胞のプレートから培地を取り除きます。次に、2ミリリットルの温かい1X PBSで細胞を洗浄します。PBSを吸引した後、0