Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing:二本鎖ホモロジー依存性修復機構によるヒト多能性幹細胞のゲノム改変技術

ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはZFNには、リンカーを介してエンドヌクレアーゼドメインに接続された亜鉛イオン安定化DNA結合マクロドメインが含まれています。この構造は、DNAを切断しながら特異性を維持するのに役立ちます。

ゲノム編集にZFNを使用するには、ヒト多能性幹細胞の培養を行います。ZFNをコードするプラスミドで補完します。標的遺伝子と抗生物質耐性遺伝子を含む修復プラスミドを相同性アームまたはHAの間に挟み込みます。電流が細胞内のプラスミドの侵入を促進する細胞とDNAの混合物をエレクトロポレートします。

中に入ると、翻訳されたZFNのジンクフィンガーモチーフは、宿主ゲノム内の相補的な塩基対のトリプレットに結合し、Fok-1制限エンドヌクレアーゼを標的部位に正しく配置します。ZFNは対で反対側の鎖に結合し、Fok-1ホモ二量体化が活性触媒中心を形成し、そこでFok-1がDNA二本鎖切断またはDSBを生成し、4ヌクレオチドオーバーハングを生成します。

修復プラスミド中のHAの存在は、張り出した端が反転し、相同HA配列をテンプレートとして使用する相同性依存性修復を導きます。DNA合成は、標的遺伝子に相補的なヌクレオチドを追加することによって継続されます。

結果として生じるギャップはライゲーションされ、遺伝子挿入が容易になります。さらに、プロモーターレス抗生物質耐性遺伝子は、挿入部位の上流の宿主プロモーターから発現します。編集に成功した細胞は、抗生物質選択培地で増殖します。

、ゼラチン上で増殖したマイトマイシンC不活化マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞を含む6ウェルプレート上のhESC培地でヒト多能性幹細胞を培養します。プレーティング後、hPS細胞が50%コンフルエントに達するまで、ガラスピペットと真空を使用して培地の全量を除去します。ウェルあたり3ミリリットルの温かいhESC培地と交換します。

ターゲティングの1日前に、hESC培地を取り除き、10マイクロモルのY27632を添加した新鮮な予熱したhESC培地を追加します。また、DR4マウスから薬剤耐性MEFフィーダー細胞の1〜2個の6ウェルプレートを調製します。ターゲティング当日に、5マイクログラムのジンクフィンガーヌクレアーゼ発現プラスミド1および2を1.5ミリリットルのチューブにピペッティングしてトランスフェクション溶液を調製します。

30マイクログラムの修復ドナープラスミドを加え、続いて容量を300マイクロリットルにするのに十分な1Xリン酸緩衝生理食塩水を加えます。細胞を顕微鏡で検査し、50%のコンフルエンシーを確認します。次に、ガラスピペットと真空を使用して、hPS細胞のプレートから培地を取り除きます。次に、2ミリリットルの温かい1X PBSで細胞を洗浄します。PBSを吸引した後、0.5ミリリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液を細胞に直接加えます。

組織培養インキュベーターに約10分間、またはフィーダー層がプレートから浮き上がり始めるまで置きます。インキュベーション後、2ミリリットルの温かいesWash培地を各ウェルに加えて、トリプシン反応を停止します。各ウェルから細胞を収集し、フィーダー細胞がシートとして剥がれるようにします。各ウェルの内容物を単一の50ミリリットルの円錐形チューブにピペットで移し、すべてのウェルを組み合わせ、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して細胞を粉砕します。

esWash培地を加えて、細胞懸濁液を40ミリリットルにします。大きなフィーダーチャンクがチューブの底に沈殿するまで1〜2分待ってから、血清学的ピペットを使用して上清を取り除き、新鮮な50ミリリットルの円錐形チューブに沈着させます。細胞懸濁液を190 x g で5分間遠心分離した後、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引します。細胞を500マイクロリットルの1X PBSに再懸濁します。

再懸濁した細胞を、以前に調製した血漿トランスフェクション溶液と組み合わせます。細胞とトランスフェクション混合物を4mmのエレクトロポレーションキュベットにピペットで入れ、氷上に3〜5分間置きます。エレクトロポレーションシステムの指数関数的プログラムのパラメータを、250ボルト、500マイクロファラッド、無限抵抗、および4ミリメートルのキュベットサイズに設定します。セルを電気穿孔し、キュベットを氷の上に3分間戻します。

エレクトロポレーションされた細胞を、10マイクロモルのY27632を添加した18ミリリットルの温かいhESC培地に再懸濁します。DR4 MEFを顕微鏡で検査します。3ミリリットルの単一細胞懸濁液をDR4フィーダーセルを含む6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、インキュベーターに戻します。プレーティング後3日目に、細胞上の培地をY27632を含まないhESC培地に交換します。4日目に、補充されていない培地を適切な選択抗生物質を含む培地に交換します。ここではピューロマイシンが使用されています。