誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

培養

レシピエント細胞の懸濁液をチューブに取り込むことから始めます。目的の遺伝子を含む誘導性プラスミドをチューブに補充します。この遺伝子の発現は、テトラサイクリンオペレーターまたはTetOに融合した上流のプロモーター配列の制御下にあり、テトラサイクリン応答性要素またはTREを形成します。

さらに、組換えテトラサイクリントランスアクチベータータンパク質またはtTAをコードする遺伝子を含む調節性テトラサイクリンオフベクターを追加します。細胞-DNAミックスをエレクトロポレートして電気パルスを使用して、細胞によるプラスミドの取り込みを促進します。

エレクトロポレーション後、細胞をプレーティングし、所望の時間インキュベートします。核に入ると、テトラサイクリンオフベクターはtTAタンパク質を発現します。tTAは、TetレプレッサーまたはTetR部分とウイルスVP16転写トランスアクチベータードメインを含むハイブリッドタンパク質です。

TetR 部分は TRE 要素の TetO 配列に結合し、VP16 ドメインは RNA ポリメラーゼが下流の DNA から mRNA を合成することを可能にし、最終的に遺伝子発現につながります。培養プレート内の増殖培地をドキシサイクリン含有培地に交換し、インキュベートします。

合成テトラサイクリン類似体であるドキシサイクリンは、TetRタンパク質に結合し、そのコンフォメーションを変化させます。この変化により、TetR タンパク質と TetO 配列との相互作用が破壊され、標的遺伝子の発現が阻害されます。

100 mm ペトリ皿に 1 x 10 6 細胞/cm² で、完全な最小必須培地の存在下で細胞を播種します。湿度のある5%二酸化炭素で摂氏37度で24時間培養します。翌日、抗生物質を含まない500マイクロリットルの完全培地を新しい12ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で30分間予熱します。

このインキュベーション中に、1マイクログラムの応答プラスミドと1マイクログラムの調節ベクターを、ウェルあたり1つの1.5ミリリットルチューブに加えます。肺胞上皮細胞をカルシウムまたはマグネシウムを含まない摂氏37度のPBSのウェルあたり10ミリリットルで洗浄し、細胞培養インキュベーターで2〜4分間、摂氏37度の0.05%トリプシンのウェルあたり5ミリリットルで細胞を処理します。

細胞が剥離したら、抗生物質を含まない完全培地のウェルあたり10ミリリットルでトリプシンを中和し、細胞を新しい50ミリリットルのチューブに集めます。4ミリリットルの新鮮な培地で皿を洗浄して残りの細胞を収集し、遠心分離によって細胞を沈殿させます。

ペ

レットを1ミリリットルのPBSに再懸濁して計数し、細胞を再度遠心分離します。ペレットを4 x 10⁷細胞/mLの再懸濁バ