誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

レシピエント細胞の懸濁液をチューブに取り込むことから始めます。目的の遺伝子を含む誘導性プラスミドをチューブに補充します。この遺伝子の発現は、テトラサイクリンオペレーターまたはTetOに融合した上流のプロモーター配列の制御下にあり、テトラサイクリン応答性要素またはTREを形成します。

さらに、組換えテトラサイクリントランスアクチベータータンパク質またはtTAをコードする遺伝子を含む調節性テトラサイクリンオフベクターを追加します。細胞-DNAミックスをエレクトロポレートして電気パルスを使用して、細胞によるプラスミドの取り込みを促進します。

エレクトロポレーション後、細胞をプレーティングし、所望の時間インキュベートします。核に入ると、テトラサイクリンオフベクターはtTAタンパク質を発現します。tTAは、TetレプレッサーまたはTetR部分とウイルスVP16転写トランスアクチベータードメインを含むハイブリッドタンパク質です。

TetR 部分は TRE 要素の TetO 配列に結合し、VP16 ドメインは RNA ポリメラーゼが下流の DNA から mRNA を合成することを可能にし、最終的に遺伝子発現につながります。培養プレート内の増殖培地をドキシサイクリン含有培地に交換し、インキュベートします。

合成テトラサイクリン類似体であるドキシサイクリンは、TetRタンパク質に結合し、そのコンフォメーションを変化させます。この変化により、TetR タンパク質と TetO 配列との相互作用が破壊され、標的遺伝子の発現が阻害されます。

100 mm ペトリ皿に 1 x 10 6 細胞/cm² で、完全な最小必須培地の存在下で細胞を播種します。湿度のある5%二酸化炭素で摂氏37度で24時間培養します。翌日、抗生物質を含まない500マイクロリットルの完全培地を新しい12ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で30分間予熱します。

このインキュベーション中に、1マイクログラムの応答プラスミドと1マイクログラムの調節ベクターを、ウェルあたり1つの1.5ミリリットルチューブに加えます。肺胞上皮細胞をカルシウムまたはマグネシウムを含まない摂氏37度のPBSのウェルあたり10ミリリットルで洗浄し、細胞培養インキュベーターで2〜4分間、摂氏37度の0.05%トリプシンのウェルあたり5ミリリットルで細胞を処理します。

細胞が剥離したら、抗生物質を含まない完全培地のウェルあたり10ミリリットルでトリプシンを中和し、細胞を新しい50ミリリットルのチューブに集めます。4ミリリットルの新鮮な培地で皿を洗浄して残りの細胞を収集し、遠心分離によって細胞を沈殿させます。

レットを1ミリリットルのPBSに再懸濁して計数し、細胞を再度遠心分離します。ペレットを4 x 10⁷細胞/mLの再懸濁バッファーの密度で再懸濁し、プラスミドとベクターの各チューブに4 x 10⁵細胞を穏やかに混合して添加します。エレクトロポレーション装置にチューブを1本入れ、チューブに3.5ミリリットルの電解バッファーを入れます。

ピストンを完全に押し下げて、金メッキの電極チップをピペットに挿入し、チューブの内容物を穏やかに混合します。ピペットで細胞を慎重に吸引し、カチッという音がするまでピペットをエレクトロポレーションステーションに挿入します。肺胞上皮細胞に適切なエレクトロポレーションプロトコルを選択し、タッチスクリーンの[開始]を押します。

トランスフェクションの直後に、ピペットを取り外し、細胞を予熱した12ウェルプレートの1つのウェルに移します。すべての細胞がエレクトロポレーションされ、プレーティングされたら、プレートを細胞培養インキュベーターに入れ、2日後に各ウェルの上清を抗生物質を含む完全培地に置き換えます。トランスフェクションの成功は、蛍光顕微鏡またはコントロールベクターを使用したフローサイトメトリーで観察されるEGFPの発現によって確認できます。

目的の遺伝子の転写を阻害するために、トランスフェクションの72時間後に、上清を、新たに調製したドキシサイクリン1ミリリットルあたり1マイクログラムを添加した完全培地のウェルあたり1ミリリットルに置き換えます。目的の遺伝子のmRNA半減期を評価するには、プレートを15分から6時間まで細胞培養インキュベーターに戻します。

フェノールクロロホルムRNA抽出キットからの500マイクロリットルの溶解バッファーで細胞を溶解する前に、1ミリリットルの氷冷PBSで1ウェルを洗浄し、各実験時点で穏やかに振とうします。次に、キットの指示に従ってRNAを単離し、230、260、および280ナノメートルで分光光度法によってRNA収量と純度を決定します。