組換えアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子導入:げっ歯類モデルにおける導入遺伝子導入および心臓特異的発現のための技術

組換えアデノ随伴ウイルス rAAV は、特定の細胞型を標的とし、その遺伝子を宿主細胞核に輸送して遺伝子発現するように遺伝子操作された小さな一本鎖 DNA ウイルスです。

凍結麻酔をかけたマウスの子犬を拘束することから始めます。背中の皮膚を滅菌し、心臓特異的プロモーターに沿って目的の導入遺伝子を運ぶrAAVベクターを皮下注射します。ベクターは血管系に吸収され、心臓を含む遠くの臓器に到達します。

ここで、組換えウイルスは心筋細胞の表面に付着し、エンドサイトーシスを介してエンドソームに内在化されます。エンドソーム内では、ウイルスのキャプシドが部分的に分解され、ウイルスの溶解タンパク質が露出します。このタンパク質はエンドソーム膜に細孔を誘導し、そこからベクターは細胞質に逃げます。

ベクターは細胞質微小管を横切って移動し、核孔を通って入ります。核に入ると、ウイルスのカプシドは分解されてゲノムを放出します。次に、標的遺伝子を運ぶ一本鎖DNAは二本鎖DNAに変換されます。

DNA転写に続いて、生成されたmRNAは細胞質に移動します。ここで、mRNAは翻訳を受け、心筋細胞で標的タンパク質を発現します。さまざまな臓器からの組織サンプルを蛍光顕微鏡で観察し、心臓への遺伝子送達の効率と組織特異性を判断します。

テキストプロトコルに従ってウイルス力価を決定した後、1〜7 x 10¹²粒子/ミリリットルのウイルス力価でrAAV9作業溶液を調製します。新生マウスを治療するには、rAAV9溶液を使用して、気泡を避けて、0.33 x 12.7ミリリットルのインスリン注射器に29ゲージの1/2インチ針をプレフィルします。

子犬を凍結麻酔した後、親指と人差し指で片手で子犬を持ちます。次に、70%イソプロピルアルコールで飽和させた綿棒で子犬の背中の皮膚をスワイプします。50〜70マイクロリットルのrAAV9溶液を注入する前に、シリンジ針を動物の前背側皮下に5〜10度の角度で挿入します。