蚊胚マイクロインジェクション:ハマダラカの胚卵黄に外因性DNAを送達して生殖細胞変異を生成する技術

外因性DNAをアノフェレス胚にマイクロインジェクションするには、収穫したばかりの胚盤葉前の蚊の卵を希望の数採取します。この初期の発達段階では、卵子は細胞構造を形成せずに核を含んでいます。

スライドガラスの表面にある湿ったあぶらとら紙の周囲にボート型の卵を置きます。このステップにより、後続のステップでの注入が容易になるように、胚の適切な水分補給が保証されます。腹側面を外側に露出させて、卵を互いに隣接して整列させます。

次に、目的のプラスミド溶液を含む狭口径マイクロインジェクション針を取ります。解剖顕微鏡を使用して、卵の後極(生殖細胞前駆体の部位)の近くに針を配置します。針を適切な角度で挿入し、外絨毛膜(外層)と内絨毛膜(卵殻の内層)を貫通し、最終的に胚に到達します。

プラスミドミックスを胚の卵黄に注入します。針をそっと引っ込め、適切な条件下で卵子が成長するのを待ちます。卵が成長するにつれて、一部の核は後極に移動し、そこでマイクロインジェクションされたDNAを取り込むことができます。これらの核は後に配偶子、つまり遺伝性生殖細胞変異を引き起こす可能性のある性細胞になります。

形質転換された表現型の成蚊を視覚化します - マイクロインジェクションの成功を確認する後続の世代で観察可能な特徴。

マイクロローダーチップを使用して、2マイクロリットルのDNA混合物を針に充填します。ニードルホルダーに針を挿入し、自動圧力ポンプチューブを接続します。スライドの平面と15度の角度になるように針を合わせます。

最初の卵に注意深く触れて針先を開きます。次に、針の先端を後極の約10マイクロメートルまで挿入します。注射が成功すると、卵子内の細胞質の小さな動きが起こります。

顕微鏡の同軸ステージコントロールを使用して、次の卵に移動し、注入を続行します。針先が開いたままで詰まっていないことを確認するには、別の胚に入る前に「注入」ボタンを押し、針の開口部にある小さな液滴を視覚化します。針が詰まった場合は、「クリア」ボタンを押して針をクリアし、液滴の視覚化テストを繰り返します。

針先の開口部がわずかに大きくなった場合は、必要に応じて圧力を調整して、液滴のサイズが小さく保たれるようにします。1本の針で約40〜50個の卵を注入します。注射が完了したら、濾紙を敷き、50ミリリットルの脱イオン水を入れたガラス容器に卵をすすぎます。