JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 3:48 分 • July 8th, 2025
流体力学的遺伝子導入を実行するには、目的の遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを含む生理食塩水ベースの溶液で満たされた注射器を取ります。続いて、マウスモデルを取り、大量のプラスミド溶液を尾部の付け根に急速に注入し、プラスミド溶液が尾静脈に静脈内注射されるようにします。
大量のプラスミドを加圧注入すると、流体力と呼ばれる機械的な力が発生し、下大静脈(脱酸素化された血液を心臓に運ぶ静脈)の血管内圧が上昇します。
液体の量が多いと、心臓の右心室にうっ血が誘発され、血液方向への逆転が強制されます。このステップにより、プラスミド溶液が肝静脈に強制的に入り、肝静脈が肝臓に運
びます。プラスミドは、肝の正弦波 - 内皮細胞で裏打ちされた肝臓の空間 - 内を移動します。血液量の増加は、プラスミドが内皮層を透過化するのを助け、プラスミドが周囲の肝細胞(肝細胞)の近くに到達するのを助けます。
プラスミド溶液の急速な流入は、肝細胞膜に圧力を誘発し、一過性の細孔を生成します。これらの細孔は、細胞によるプラスミドDNAの取り込みを促進します。その後、膜細孔が閉じ、プラスミドを肝細胞内に閉じ込めます。
肝細胞における目的遺伝子の発現の成功は、トランスフェクションを裏付ける。
マウスの体重を量ることから始め、次に、生理食塩水エンドトキシンフリーの眠れる森の美女ベクターコンストラクト1ミリリットルあたり1マイクログラムと、1ミリリットルあたり1マイクログラムのエンドトキシンフリーpc-HSB5を含む滅菌生理食塩水を調製します。各マウスに体重の10%の量を注射するのに十分な溶液を準備します。滅菌3ミリリットルの注射器に1匹のマウスに必要な量を充填し、27ゲージの針を取り付けます。
適切な量のティッシュペーパーを追加して、移動のためのスペースを最小限に抑え、呼吸のための十分なスペースを残した後、マウスを呼吸穴のある適切な拘束器に挿入します。赤外線ランプを使用して尾を30〜60秒間温め、尾の急速な動きやその他の動揺の兆候など、過熱の兆候を注意深く観察してから、アルコール綿棒で尾をきれいにします。
尾の付け根に近い2つの外側尾静脈のいずれかに針をほぼ水平に挿入します。うまく配置されると、少量の血液が針の円錐形に逆流する可能性があります。8〜10秒以内に尾静脈に総量を注入します。注射後、すぐにマウスを拘束器から取り外します。注射傷を滅菌ガーゼで少なくとも 30 秒間、または出血が治まるまで圧迫します。
流体力学的尾静脈注入の成功はトランスフェクションにとって非常に重要であり、特に注入速度、量、および時間に依存します。静脈内注射を容易にするために、注射当日にマウスにストレスや脱水症状がかからないようにしてください。
回復ケージで30〜60分間単独でハウジングした後、マウスを元のケージに戻します。