アグロバクテリウムを介した遺伝子形質転換:遺伝子改変アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるイネゲノムの遺伝子組み換え法

植物病原性細菌であるアグロバクテリウム・ツメファシエンスは、人工的に調製したTiプラスミドを導入し、その転移DNAまたはT-DNA領域に目的の遺伝子を運び、病原性またはVir遺伝子を運ぶヘルパープラスミドを導入することで遺伝子操作を行うことができます。

アグロバクテリウムを介した遺伝子形質転換の場合は、若いイネの花序から始めて、それを細かく切ります。挿し木を増殖培地に移し、インキュベートして、カルスと呼ばれる未分化細胞塊への挿し木の成長を促進します。

次に、カルスをアグロバクテリウムの化学誘引剤であるアセトシリンゴンを含むアグロバクテリウム浸潤培地に移します。次に、遺伝子組み換えアグロバクテリウムの培養物を培地に加え、短時間インキュベートします。

アセトシリンゴン分子は、アグロバクテリウム膜上の細胞受容体タンパク質 - VirA - を活性化し、転写活性化タンパク質 - VirG のリン酸化をさらに媒介します。リン酸化されたVirGはヘルパープラスミドに向かって移動し、チャネルタンパク質やエンドヌクレアーゼ(VirD1およびVirD2)を含む病原性遺伝子のカスケードの転写を活性化します。

チャネルタンパク質は細菌細胞と植物細胞を結ぶ輸送チャネルを形成しますが、エンドヌクレアーゼはTiプラスミドの境界配列に結合し、一端で結合したVirD2でT-DNAを切断します。その後、VirD2 は輸送チャネルを介してカルス細胞への T-DNA の侵入を指示し、イネゲノムへの統合を促進します。

各花序を70%アルコール綿棒で拭き、乾かしてから切ります。花序を滅菌実験台に持ってきて、滅菌したハサミで細かく切ります。次に、挿し木をNBD2培地を含むペトリプレートに移します。

プレートを摂氏26度の暗所で10〜14日間インキュベートして、カルスを誘導します。形質転換を行うには、選択的抗生物質を含むYEBプレートから、50ミリリットルの円錐形滅菌試験管で、同じ抗生物質を含む5ミリリットルの液体YEB培地に単一のコロニーを移します。細菌がOD₆₀₀ 0.5に増殖するまで、オービタルシェーカーで250 x g、摂氏25〜28度でチューブを振とう。

1ミリリットルの細菌懸濁液を、同じ選択的抗生物質を含む100ミリリットルのYEB培地に、250ミリリットルのコニカルフラスコに入れ、250 x g、摂氏28度のオービタルシェーカーでフラスコを4時間振とうします。培養物を室温で4,000 x gで10分間遠心分離し、細菌を収集します。上清を廃棄し、ペレットをAAM-AS培地で再懸濁し、懸濁液をOD₆₀₀ 0.4に希釈します。

インキュベーション後、約150個の健康で薄黄色の胚形成カルを150ミリリットルの滅菌フラスコに集めます。50〜75ミリリットルの細菌細胞懸濁液をフラスコに加え、次に10〜25ミリリットルの新鮮なAAM-AS培地を加えて、カルスを10〜20分間浸し、時々振とうします。

細菌懸濁液をフラスコから慎重に注ぎ、滅菌ろ紙でカルスを乾かします。次に、NBD-AS培地を入れたシャーレの上に置き、ろ紙で覆います。カルスを摂氏25〜28度の暗所で3日間インキュベートし、細菌の異常増殖がないか確認します。

3日間の共培養後、ろ紙を使用してカルスを滅菌ペトリ皿に移し、清潔なベンチで2時間自然乾燥させます。カルリがろ紙に付着していないことを確認し、一次選択培地NBD2に移します。

2週間後、カルスを新鮮な選択培地を含む新しいプレートに均等に移します。次に、カルイを新鮮なMS培地に移して分化し、芽をMS培地(10 mg/Lのハイグロマイシンを含む)に移して、より多くの芽を増殖させます。