エレクトロポレーションを介したIn vitro遺伝子導入:蛍光レポータータンパク質をコードするプラスミドを培養細胞に導入するための電気パルス技術

エレクトロポレーションベースのプラスミドDNAを初代ニューロン細胞に送達するには、適切なエレクトロポレーション培地に細胞を懸濁することから始めます。蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNAを加えて、エレクトロポレーション混合物を調製します。

エレクトロポレーション効率に悪影響を与える可能性のある気泡を避けながら、エレクトロポレーション混合物をエレクトロポレーションキュベットに穏やかに移します。キュベットをエレクトロポレーターのキュベットホルダーに移します。エレクトロポレーションパラメータを設定します。エレクトロポレーションを開始します。

細胞膜を横切って印加された高電圧の短い電気パルスは、膜の両側に異なる電荷蓄積を引き起こし、膜貫通電位、細胞膜を横切る電圧を増加させます。

誘導された膜貫通電位が脂質二重層破壊電位を超えると、脂質二重層は局所的な配置の変化とともに不安定になり、細胞膜上に一過性の親水性細孔が形成されます。適切なサイズの細孔は、プラスミドDNAが細胞質に入るための経路を提供します。

エレクトロポレーションが完了すると、脂質二重層が再密閉され、細胞膜二重層の完全性が回復し、それによってプラスミドDNAが閉じ込められます。さらに、核膜、核を取り囲む二重層膜が分解される細胞周期の段階で、プラスミドDNAが核に転座します。

エレクトロポレーションされた細胞を、タンパク質でコーティングされたカバーガラスを備えたマルチウェルプレートの培地含有ウェルにプレートします。細胞がタンパク質でコーティングされたカバーガラスに付着するようにインキュベートします。プラスミドDNAを含むトランスフェクト細胞は蛍光タンパク質を発現することに成功した

まず、コーティングされたカバーガラスを含む24ウェル培養プレートの各壁に0.5ミリリットルの培地を加え、二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度に保温します。必要な数の細胞を滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで入れ、室温で200 x g で5分間回転させます。

上清を廃棄し、細胞ペレットを200マイクロリットルのOpti-MEMに再懸濁します。この手順を2回繰り返して、チューブ内に培養液が残らないようにします。エレクトロポレーションのパラメータをリストに従って設定します。エレクトロポレーション反応を穏やかにピペットで混ぜてよく混合し、長いP200ピペットチップを使用して、100マイクロリットルの混合物の正確な量を2ミリメートルのギャップキュベットに移します。

キュベットがキュベットチャンバー内に入ったら、エレクトロポレーターのオメガボタンを押し、100マイクロリットルの正確な容量を守ってインピーダンス値を記録します。インピーダンス値の範囲は、約30と35である必要があります。

スタートボタンを押してパルスを開始します。測定された電流値と宝石を読み取りフレームに表示して記録します。キュベットをチャンバーから取り出します。

すぐに100マイクロリットルの予熱培地をキュベットに加え、上下に2〜3回ピペッティングして再懸濁します。細胞懸濁液をすぐに、以前に調製した24ウェルプレートに移します。細胞を二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。