寄生虫形態のヌクレオフェクション:蛍光タンパク質コードプラスミドをスポロゾイト核に送達するためのエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法

核受染によってプラスミドをスポロゾイト核に送達するには、単離された生存可能なスポロゾイト(寄生虫の運動性、感染段階)を緩衝液に懸濁することから始めます。スポロゾイトは、外側の原形質膜と、構造の安定性と運動性に重要な一連の平らな小胞とタンパク質からなる下にある内膜複合体に囲まれた細い形状の細胞です。

懸濁液を遠心分離して、スポロゾイトをペレット化します。スポロゾイトペレットを、蛍光タンパク質をコードするプラスミドを添加した適切な量の核トランスフェクションバッファーに再懸濁します。高い緩衝能力とイオン強度を備えた核トランスフェクションバッファーは、スポロゾイトの機能を維持しながら効率的なトランスフェクションを保証します。

懸濁液を核トランスフェクションキュベットに移します。キュベットを核保護装置のホルダーに入れます。適切な核フェクションプログラムを実行します。

核受動中、特異的に適用された短い高電圧パルスは、緩衝成分とともに、原形質膜と内膜複合体を一時的に破壊し、膜貫通孔を形成し、プラスミドが細胞質にアクセスできるようにします。

同時に、これらの高強度電場は、核を取り囲む二重層の核膜も乱し、一過性のギャップを発生させ、細胞分裂を必要とせずにプラスミドの核への直接侵入を促進します。

核フェクションが完了すると、細胞膜と核膜の細孔が再密閉され、細胞内にプラスミドを閉じ込めながら膜の完全性と恒常性が回復します。

キュベットを装置から取り外します。スポロゾイトの回収に適した培地を追加し、新しいチューブに移します。プラスミドDNAを有する核脱落スポロゾイトは蛍光蛋白質を発現することに成功した

まず、スポロゾイトまたはメロゾイト懸濁液を600 x g で10分間遠心分離し、次に上清を廃棄します。次の順序で、85マイクロリットルの核トランスフェクションバッファー、10マイクログラムのプラスミド、および25単位の制限酵素を、スポロゾイトまたはメロゾイトを含む1.5ミリリットルのチューブに加えます。懸濁液を核トランスフェクションカップに移します。

カップを核転移溝に入れ、電源ボタンを使用して核フェクション装置をオンにし、トランスフェクション手順U-033を選択します。プログラムが終了したら、核フェクションデバイスのXボタンを押すと、画面にOKと表示され、核フェクションが成功したことを示します。0.5〜1ミリリットルのダルベッコの修飾イーグル培地を核フェクションカップに加えて反応を停止します。

穏やかに混合した後、懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。