レーザー支援レンチウイルス遺伝子導入:レンチウイルス遺伝子導入を促進するためにマウス受精卵を透過化する技術

レーザー支援レンチウイルス遺伝子送達は、導入遺伝子を宿主系に導入する技術です。

トランスジェニックマウスを生産するには、適切な培地で単離されたマウス受精卵から始めます。受精卵を含む培養皿を、レーザー装置があらかじめ取り付けられ、制御ソフトウェアに取り付けられた顕微鏡ステージに置きます。適切な倍率で観察してください。

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精卵は、レンチウイルス粒子をバリアする保護糖タンパク質層である透明帯に囲まれています。このバリアを透過するには、レーザー装置の電源を入れ、レーザーLEDが透明帯の上に見えることを確認します。制御ソフトウェアを使用して、レーザーを発射します。希望のミシン目直径に応じて発射時間を調整します。

卵をインキュベーターに入れて回収します。短いインキュベーションの後、卵を取り出し、目的の遺伝子と蛍光選択可能なマーカーを運ぶレンチウイルス粒子を追加します。

透明帯に穴が開いていると、レンチウイルスは卵細胞膜に向かって容易に拡散し、エンドサイトーシスを介して侵入します。レンチウイルスは分解してRNAを放出し、二本鎖DNAに順次処理されると宿主核に入り、外来遺伝子を宿主ゲノムに統合します。

卵を孵化させ、胚盤胞に成長させます。胚盤胞を交尾した雌マウスに移植します。妊娠が完了したら、子犬を回収し、導入遺伝子の存在を分析します。

卵がインキュベーターにある間に、メーカーの推奨に従ってXYCloneレーザーをセットアップして校正します。卵の準備ができたら、最初のドロッププレートをレーザー顕微鏡ステージに置き、透明帯に手動で焦点を合わせます。レーザーLED光が対物レンズを通して見えることを確認した後、顕微鏡ステージを動かしてLEDレーザーで帯をターゲットにし、コンピューターソフトウェアを使用してXYCloneレーザーを250マイクロ秒に設定します。

LEDライトのサイズを適切な寸法に調整し、各卵の透明帯にレーザーで3回穴を開けて、10マイクロメートルの穴を3つ作成します。

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精卵はインキュベーターの外に15分以上置いておくことができないため、穿孔を迅速かつ慎重に行うことが重要です。

次に、穴あき卵をインキュベーターにさらに2時間戻します。2回目のインキュベーションの終わりに、50マイクロリットルのKSOMドロップを2マイクロリットルの濃縮レンチウイルスで混合せずに処理し、卵をインキュベーターに4日間戻します。卵子が胚盤胞に発達したら、非外科的胚移植装置を使用して、約10〜15個の胚を約2マイクロリットルのKSOMに沈着させます。

胚移植の17日後、妊娠中のマウスを自然に出産させるか、必要に応じて帝王切開で新生児を採取します。