Biolistic-Mediated Gene Transfers:Biolistic Gene Gunを介して標的細胞に目的の遺伝子を送達する技術

まず

、最適な量の金ビーズ(生物学的に不活性で無毒な遺伝子送達ビヒクル)を微量遠心チューブに入れます。次に、カチオン剤 - スペルミジンと塩化カルシウムを加え、続いて目的の DNA 断片を金ビーズに加えます。チューブをそっとフリックしてインキュベートします。

塩化カルシウムはDNA断片に結合し、スペルミジン残基を介して金ビーズ上のコーティングを促進します。次に、溶媒を遠心分離して除去します。DNAでコーティングされたビーズをエタノールに再懸濁します。滅菌マクロキャリアディスク上でビーズをそっとピペットで移動させます。乾かします。

ヘリウムガス加速管と、それぞれのスロットにラプチャーディスクと停止スクリーンを備えた砲撃室で構成されるバイオリスティック遺伝子銃装置を設置します。次に、マクロキャリアディスクを反転させ、ラプチャーディスクの下にロードします。

その後、培養した標的宿主細胞を、形質転換効率を向上させるための浸透圧安定剤であるソルビトールを添加した適切な固体培地に入れます。セットアップの準備ができたら、遺伝子銃を発射します。

ヘリウムが加速管を下って移動すると、ラプチャーディスクが破損するまで圧力が上昇し続け、ヘリウム衝撃波が発生します。これらの衝撃波は、金のビーズを運ぶマクロキャリアディスクを停止スクリーンに向かって駆動し、金のビーズのみが通過できるようにします。

加速された金ビーズは宿主細胞核に浸透し、目的のDNAを宿主細胞ゲノムに組み込みます。

まず、鉗子を使用してオレンジ色のマクロキャリアバイオリスティックディスクを100%エタノールに沈め、ディスクが乾燥剤に触れないように注意しながら、ドライアライトを含む大きなペトリ皿にディスクを移します。乾燥したら、ディスクをエタノールで拭き取った銀ディスクホルダーに押し込み、次に金ビーズのチューブをボルテックスし、12マイクロリットルのビーズ溶液を変換ごとに1つの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。

次に、2マイクログラムのDNA、10マイクロリットルの塩化カルシウム、および2マイクロリットルのスペルミジン遊離塩基をビーズの各チューブに順次加えます。次に、各サンプルをボルテックスし、チューブを周囲温度で5分間インキュベートし、時々穏やかにフリックして沈殿したビーズを再懸濁させます。

インキュベーションの最後に、DNAコーティングされた金ビーズをペレット化し、上清を慎重に吸引します。ビーズを600マイクロリットルの100%エタノールにゆっくりと完全に再懸濁し、次に細胞を再びペレット化し、今度はビーズを8マイクロリットルのエタノールに再懸濁します。

次に、ビーズの各チューブを直径1センチメートルの円で個々のバイオリスティックディスクの中心に分配します。十分な濃度のビーズが存在する場合、ビーズが乾くと