JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 5:33 分 • July 8th, 2025
、最適な量の金ビーズ(生物学的に不活性で無毒な遺伝子送達ビヒクル)を微量遠心チューブに入れます。次に、カチオン剤 - スペルミジンと塩化カルシウムを加え、続いて目的の DNA 断片を金ビーズに加えます。チューブをそっとフリックしてインキュベートします。
塩化カルシウムはDNA断片に結合し、スペルミジン残基を介して金ビーズ上のコーティングを促進します。次に、溶媒を遠心分離して除去します。DNAでコーティングされたビーズをエタノールに再懸濁します。滅菌マクロキャリアディスク上でビーズをそっとピペットで移動させます。乾かします。
ヘリウムガス加速管と、それぞれのスロットにラプチャーディスクと停止スクリーンを備えた砲撃室で構成されるバイオリスティック遺伝子銃装置を設置します。次に、マクロキャリアディスクを反転させ、ラプチャーディスクの下にロードします。
その後、培養した標的宿主細胞を、形質転換効率を向上させるための浸透圧安定剤であるソルビトールを添加した適切な固体培地に入れます。セットアップの準備ができたら、遺伝子銃を発射します。
ヘリウムが加速管を下って移動すると、ラプチャーディスクが破損するまで圧力が上昇し続け、ヘリウム衝撃波が発生します。これらの衝撃波は、金のビーズを運ぶマクロキャリアディスクを停止スクリーンに向かって駆動し、金のビーズのみが通過できるようにします。
加速された金ビーズは宿主細胞核に浸透し、目的のDNAを宿主細胞ゲノムに組み込みます。
まず、鉗子を使用してオレンジ色のマクロキャリアバイオリスティックディスクを100%エタノールに沈め、ディスクが乾燥剤に触れないように注意しながら、ドライアライトを含む大きなペトリ皿にディスクを移します。乾燥したら、ディスクをエタノールで拭き取った銀ディスクホルダーに押し込み、次に金ビーズのチューブをボルテックスし、12マイクロリットルのビーズ溶液を変換ごとに1つの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。
次に、2マイクログラムのDNA、10マイクロリットルの塩化カルシウム、および2マイクロリットルのスペルミジン遊離塩基をビーズの各チューブに順次加えます。次に、各サンプルをボルテックスし、チューブを周囲温度で5分間インキュベートし、時々穏やかにフリックして沈殿したビーズを再懸濁させます。
インキュベーションの最後に、DNAコーティングされた金ビーズをペレット化し、上清を慎重に吸引します。ビーズを600マイクロリットルの100%エタノールにゆっくりと完全に再懸濁し、次に細胞を再びペレット化し、今度はビーズを8マイクロリットルのエタノールに再懸濁します。
次に、ビーズの各チューブを直径1センチメートルの円で個々のバイオリスティックディスクの中心に分配します。十分な濃度のビーズが存在する場合、ビーズが乾くと、各ディスクの中央に金色の円が表示されます。
遺伝子ガンを操作するには、まず真空ポンプをオンにし、次に圧力計の圧力が約2200 PSIに達するまでヘリウムタンクノブを反時計回りに回します。次に、左の赤いスイッチを切り替えてジェネガンをオンにし、真空と通気口の流量を調整して、真空が15秒以内に水銀の28インチに達するようにします。このとき、ラプチャーディスクとマクロキャリアの間の距離も約3/8インチであることを確認します。
すべてが所定の位置に整ったら、チャンバー全体を70%エタノールで拭き取り、ラプチャーディスクを100%エタノールに浸します。無菌面でディスクを乾燥させた後、トルクレンチを使用してラプチャーディスクホルダーを緩め、きれいなディスクを挿入します。ラプチャーディスクホルダーを元の位置にねじ込み、トルクレンチで右に一度回して締めます。
次に、メッシュスクリーンを100%エタノールに浸します。乾いたら、白いプラスチック製の取り付けプレートにスクリーンを置き、マクロキャリアディスクホルダーをDNA側を下にしてディスクチャンバーに入れます。シルバーキャップをねじ込み、取り付けプレートを一番上のスロットに置き、次に、1モルソルビトールを含むYPD寒天プレートを底板に置きます。
チャンバーのドアを閉じて所定の位置にロックし、中央の赤いスイッチを上の位置に押し続けて真空を作動させ、水銀柱が28インチに達するようにします。適切な真空レベルに達し、中央のスイッチが下の位置に移動したら、右の赤いスイッチを押したままにして発火します。
ラプチャーディスクが弾けたら、すぐに発射ボタンを放し、中央の赤いスイッチを中央の位置に押して、チャンバーを0PSIに通気します。ショットが成功すると、プレートに金のリングが見えます。ラプチャーディスクとマクロキャリアディスクの破片を取り除き、遺伝子ガンの電源を切り、ヘリウムタンクノブを時計回りに回してガスをオフにし、真空ポンプをオフにします。