レトロウイルス媒介遺伝子導入:遺伝子組換えレトロウイルスベクターを用いて培養細胞に導入遺伝子を導入するための遺伝子導入技術

レトロウイルスベクターを含むRNAで宿主細胞を形質導入するには、適切な培地にパッケージ化されたベクターを含むチューブを取ります。各ベクターには、宿主ゲノムと重要なウイルス酵素に組み込まれる導入遺伝子のRNA補体を含むウイルスキャプシドが含まれています。脂質二重層がキャプシドを取り囲み、宿主細胞への侵入を容易にします。

適切なトランスフェクション試薬の存在下で、宿主細胞懸濁液を含む培養プレートのウェルにベクターを添加します。プレートを覆います。スピン変換を可能にするために低速で遠心分離します。これにより、ウイルスベクターが宿主細胞表面に近づき、形質導入効率が向上します。

同時に、トランスフェクション試薬中のポリカチオンは、ウイルスと宿主細胞の負電荷を中和し、標的細胞へのウイルスの吸着を促進します。

その結果、ウイルス表面の受容体は、宿主膜との融合を促進します。ウイルスのキャプシドは細胞に入って破裂し、トランスジェニックRNAとウイルス酵素を細胞質に放出します。

細胞質内では、ウイルス逆転写酵素がRNAを一本鎖相補DNAに変換し、その後二本鎖プロウイルスDNAに変化させます。得られたDNAは核に入ります。ウイルスインテグラーゼ酵素は、プロウイルスDNAの宿主ゲノムへの組み込みを媒介し、形質導入された細胞をもたらします。

ウイルス生産者細胞株から新鮮なウイルス上清を採取します。この時点で、細胞は定義された形態で十分な間隔をあける必要があります。次に、骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルから上部2ミリリットルの培地を慎重に吸引します。通常、井戸の真ん中に集中している骨髄細胞を吸引することは避けてください。

新たに添加されたウイルス上清3ミリリットルを、骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートをプラスチックで包んだ後、スピン形質導入を繰り返し、包装を外したプレートを組織培養インキュベーターに入れます。3日目の24時間後、ウェルから2ミリリットルの培地を取り出して交換します。